SM22α在結直腸癌中的表達及與肝臟轉移的相關性

趙斌 劉亞斌 王光林

(河北醫科大學附屬哈勵遜國際和平醫院普外二科，河北 衡水 053000)

結直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，結直腸癌肝轉移的發生率高，是影響其預后的重要因素〔1〕。平滑肌(SM)22α是一種細胞骨架相關蛋白，能夠調控細胞生長及細胞外基質降解〔2〕，并在惡性腫瘤組織如肺癌、前列腺癌和乳腺癌等表達下調。本研究旨在檢測SM22α在結直腸癌中的表達，并分析與肝臟轉移的相關性，進一步探討其在結直腸癌轉移中的分子機制。

1 材料和方法

1.1標本采集 63例結直腸癌腫瘤組織及癌旁組織(距腫瘤組織10 cm以外正常腸管黏膜組織)，其中9例肝臟轉移腫瘤組織，取材自河北醫科大學附屬哈勵遜國際和平醫院普外科2017年1月至2018年6月患者術中，標本提取組織蛋白或使用4%多聚甲醛固定24 h后通過石蠟包埋制作石蠟包塊。

1.2試劑 兔抗人SM22α多克隆抗體購自美國Abcam公司(ab14106)，兔抗人基質金屬蛋白酶(MMP)-9單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司(13667)，免疫組織化學SP染色試劑盒二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑購自北京中杉金橋生物有限公司。

1.3Western印跡法 術中切除組織使用生理鹽水沖洗，置于加有RIPA蛋白裂解液的研磨器中充分研磨，冰上靜置后離心，吸取上清液并進行蛋白定量。加入6×上樣緩沖液(1∶5體積比)并煮沸5 min，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，一抗孵育過夜后置于相應二抗處理，應用電化學發光(ECL)顯影液進行蛋白顯影，目的蛋白與內參蛋白標準化后得到相對比值。

1.4免疫組織化學染色 石蠟包塊連續切片，組織染色采用SP法，組織切片60℃烤片4 h，二甲苯脫蠟、乙醇水化及蒸餾水洗滌，121℃高壓抗原修復5 min，0.3%過氧化氫處理30 min，一抗孵育過夜，復溫后滴加二抗處理1 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗并滴加DAB顯色液顯色，蘇木素復染并脫水、透明和封片處理，置于顯微鏡下觀察。每張免疫組化選取5個視野拍照，染色棕黃色表示陽性，統計300個腫瘤細胞或正常細胞中陽性細胞數，根據陽性細胞所占比例判斷表達水平：其中陰性(-)≤5%和陽性(+)>5%。

1.5統計學分析 使用SPSS19.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗、Pearson相關分析。

2 結 果

2.1結直腸癌組織及癌旁組織SM22α表達 結直腸癌組織中共有15例(23.8%)染色陽性，癌旁組織中共有57例(90.5%)染色陽性，與癌旁組織相比，SM22α在結直腸癌組織中表達陽性率顯著降低〔(86.61±4.37)% vs (21.53±3.49)%,P<0.01〕。見圖1。結直腸癌組織中SM22α蛋白表達較癌旁組織顯著減弱(0.73±0.13 vs 1.41±0.32,P<0.05)。見圖2。

2.2結直腸癌肝臟轉移組織與結直腸癌原位組織SM22α表達比較 結直腸癌組織中共有15例(23.8%)染色陽性，在肝臟轉移結直腸癌組織中共有1例(11.1%)染色陽性，與結直腸癌組織相比，SM22α在肝轉移結直腸癌組織中陽性率顯著降低〔(21.53±3.49)% vs (10.28±1.54)%,P<0.05〕。見圖3。結直腸癌組織中SM22α蛋白表達顯著高于肝轉移結直腸癌組織(0.73±0.13 vs 0.62±0.09,P<0.05)。見圖4。

圖1 免疫組化檢測SM22α在結直腸癌及癌旁組織表達(×400)

圖3 免疫組化檢測SM22α在結直腸癌及肝臟轉移結直腸癌組織表達(×400)

圖4 Western印跡檢測SM22α在結直腸癌及肝臟轉移結直腸癌組織中表達

2.3結直腸癌組織SM22α和MMP-9相關性分析 63例結直腸癌及9例肝臟轉移組織中SM22α和MMP-9表達均陽性者為6例，均陰性者7例；SM22α表達陽性，MMP-9表達陰性者10例；SM22α表達陰性，MMP-9表達陽性者49例。SM22α和MMP-9的表達呈負相關(r=-0.489，P<0.01)。

3 討 論

結直腸癌是胃腸道中常見的惡性腫瘤，主要依賴根治性手術切除術進行治療，而患者常常發生遠處轉移而影響生存率〔3〕。侵襲轉移是惡性腫瘤的重要生物學特征之一，是多步驟、復雜的連續性過程〔4〕，主要包括：與基膜和細胞外基質的黏附、降解和穿透、移行和定植。結直腸癌遠處轉移主要器官是肝臟，約50%的患者會發生術前或術后肝臟轉移，約有30%的患者在手術前已有B超或CT無法檢測的隱匿性肝轉移〔5〕。了解結直腸癌侵襲轉移發生機制，尋找相應阻斷途徑對結直腸癌治療有重要指導作用。既往研究證實結直腸癌侵襲轉移過程受到轉移或轉移抑制基因、細胞外基質降解、腫瘤的血管生成及腫瘤微環境等因素影響〔6〕，本研究重點探討SM22α與結直腸癌侵襲轉移的關系。

SM22α是重要的細胞骨架相關蛋白，在SM細胞中大量表達，具有調節肌肉收縮性、細胞分化、細胞遷移、組織入侵和抑制腫瘤等功能〔7〕，研究發現SM22α在肺癌〔8〕、結直腸癌〔7〕和乳腺癌〔9〕等組織中表達下調，此外SM22α高表達促進前列腺癌細胞凋亡〔10〕。本研究結果發現SM22α在結直腸癌組織中表達低于癌旁組織，提示SM22α與腫瘤發生可能存在聯系。此外研究發現肝臟轉移結直腸癌組織中SM22α表達低于結直腸癌原位組織，說明SM22α可能與結直腸癌發生肝臟轉移存在相關性。既往報道發現SM22α通過負性調控MMP-9的表達減弱細胞侵襲能力〔11〕，本研究結果顯示SM22α和MMP-9在蛋白水平存在負相關性，因此推測SM22α可能通過下調MMP-9蛋白水平調節結直腸癌侵襲轉移能力。

綜上所述，SM22α在結直腸癌組織中低表達，肝臟轉移組織中表達低于原位癌組織，SM22α與MMP-9存在負相關性，因此進一步體外探究SM22α調節結直腸癌侵襲轉移能力是下一步工作重點，為結直腸癌的防治研究和抗癌藥物的研發提供新思路。