海藻酸鈉支架復(fù)合工程化軟骨對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎兔的抗炎作用機(jī)制

周彥邑 張旭東，2 蔣雯雯 韋登明

(1寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，浙江 寧波 315211；2湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)，是一種以侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的全身性自身免疫疾病，涉及免疫系統(tǒng)中的多種細(xì)胞因子、酶等〔1〕，引起關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥、血管翳形成，并可出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)破壞，最終可導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失。RA關(guān)節(jié)軟骨損傷目前尚無理想的治療方法，傳統(tǒng)的治療可通過自體軟骨移植(如利用自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞〔2〕)和同種異體軟骨移植進(jìn)行軟骨缺損治療，但各有局限。支架材料、種子細(xì)胞和細(xì)胞生長(zhǎng)因子的組織工程技術(shù)為關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)開辟了新道路，在臨床應(yīng)用上取得顯著效果〔3，4〕。研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞間的平衡失調(diào)可能與RA的發(fā)生有著重要關(guān)系〔5，6〕。研究表明〔7〕，利用海藻酸鈉支架復(fù)合組織工程化軟骨細(xì)胞對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)導(dǎo)致的軟骨缺損有一定的療效，能夠減輕局部炎性反應(yīng)，但抗炎機(jī)制尚不清楚。本研究觀察海藻酸鈉支架復(fù)合軟骨細(xì)胞對(duì)AA兔關(guān)節(jié)滑膜Th17和Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-10、IL-22及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1的表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2月齡雄性新西蘭兔40只，清潔級(jí)，體重2～3 kg，購(gòu)自浙江省余姚泗門鎮(zhèn)建飛實(shí)驗(yàn)兔養(yǎng)殖場(chǎng)，許可證號(hào)：SCXK(浙)2012-0050。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后隨機(jī)分成正常組、模型組、支架組、軟骨細(xì)胞組、支架復(fù)合軟骨細(xì)胞組各8只。

1.2試劑 烏拉坦、Percoll細(xì)胞分離液(北京索萊寶科技有限公司)，完全弗氏佐劑(FAC)、海藻酸鈉粉劑(美國(guó)Sigma公司)，胎牛血清、RPMI1640型培養(yǎng)基(美國(guó)HyClone公司)，胰蛋白酶、阿利新藍(lán)(上海生工生物工程有限公司)，兔抗IL-10多克隆抗體、兔抗IL-22多克隆抗體、兔抗TGF-β1多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，Bio-Swamp兔IL-10、IL-22、TGF-β1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(上海橋杜生物科技有限公司)，鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、磷酸鹽緩沖液(PBS)(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3儀器 光學(xué)顯微鏡(CX40，日本Olympus公司)、臺(tái)式超高速低溫離心機(jī)(Centrifuge 5810R，德國(guó)Eppendorf公司)、超凈工作臺(tái)(C1-9，上海江龍儀表電子有限公司)、二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(3111，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)、包埋機(jī)(BM-Ⅶ，宏業(yè)醫(yī)用儀器公司)、石蠟切片機(jī)(HM-325，德國(guó)LEICA公司)。

1.4AA兔模型制備 10%烏拉坦按3 ml/kg劑量對(duì)兔耳緣靜脈進(jìn)行注射麻醉，觀察兔睫毛反射，待反射消失，向模型組和各治療組兔右膝關(guān)節(jié)內(nèi)分別注射0.5 ml FCA，2 w后再次注射，正常組注射等量生理鹽水。21 d后觀察到注射FCA的兔右膝關(guān)節(jié)局部出現(xiàn)紅腫，且較正常組明顯腫大，標(biāo)志造模成功。

1.5兔自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞 抽取軟骨細(xì)胞組和支架復(fù)合軟骨細(xì)胞組兔骨髓，自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取，分離、培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化與鑒定等各步操作參照文獻(xiàn)〔8〕。

1.6回注治療 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成功誘導(dǎo)為軟骨細(xì)胞后，向支架組兔膝關(guān)節(jié)注射0.50 ml海藻酸鹽支架；軟骨細(xì)胞組注射0.50 ml軟骨細(xì)胞懸液；支架復(fù)合軟骨細(xì)胞組注射0.25 ml海藻酸鹽支架和0.25 ml軟骨細(xì)胞懸液的混合物；模型組和正常組注射0.50 ml生理鹽水，治療1個(gè)月。

1.7兔膝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)檢查

1.7.1兔膝關(guān)節(jié)滑膜蘇木素-伊紅(HE)染色 治療結(jié)束后處死所有兔子，取各組膝關(guān)節(jié)，中性甲醛固定液固定，用乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣液進(jìn)行脫鈣4 w，取材，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，切片制作石蠟切片標(biāo)本，HE染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下鏡檢。

1.7.2膝關(guān)節(jié)滑膜免疫組化染色 石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育10 min，PBS沖洗3次，每次2 min；0.01 mol/L枸櫞酸修復(fù)液微波抗原修復(fù)6 min，沸騰后室溫放置10 min，重復(fù)2次，冷卻至室溫，PBS沖洗3次，每次3 min；5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液封閉20 min，甩掉封閉液，勿洗；組織標(biāo)本在濕盒中分別滴加IL-10、IL-22、TGF-β1一抗工作液，4℃冰箱過夜；37℃恒溫箱1 h，PBS沖洗3次，每次3 min；滴加鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶重合物(SABC)工作液，37℃恒溫箱30 min，PBS沖洗4次，每次5 min，雙蒸水洗1次；滴加DAB顯色劑，鏡下觀察適時(shí)終止顯色，雙蒸水洗1次，蘇木素輕度復(fù)染3 min，流水沖洗后溫水返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。隨機(jī)選取切片各5張，在400倍鏡下各隨機(jī)選取4個(gè)視野用JD801形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，測(cè)定各指標(biāo)陽(yáng)性產(chǎn)物的積分光密度(OD)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu) 造模21 d后，正常組兔膝關(guān)節(jié)觸摸堅(jiān)硬無紅腫；而模型組明顯紅腫。治療結(jié)束后，正常組兔膝關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，呈透明狀，關(guān)節(jié)腔內(nèi)無積液，周圍沒有出現(xiàn)組織增生的現(xiàn)象；模型組可見關(guān)節(jié)軟骨呈凹陷缺損，呈乳白色，關(guān)節(jié)腔內(nèi)可見大量積液，周圍組織增生現(xiàn)象嚴(yán)重，甚至出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形現(xiàn)象；各治療組表面光滑呈半透明狀，關(guān)節(jié)軟骨缺損部分有所改善，沒有明顯增厚的乳白色組織，但仍可見被侵蝕的痕跡。

2.2兔膝關(guān)節(jié)滑膜HE染色結(jié)果 正常組關(guān)節(jié)滑膜未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，模型組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重，各治療組較模型組炎性反應(yīng)均有所減輕。軟骨細(xì)胞組較支架組減輕的多，支架復(fù)合軟骨細(xì)胞組炎性反應(yīng)最輕，抗炎效果最好，見圖1。

2.3IL-10、IL-22、TGF-β1在兔膝關(guān)節(jié)滑膜的表達(dá) 模型組兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織IL-10表達(dá)較正常組明顯減少，IL-22、TGF-β1較正常組明顯增多(均P<0.01)；與模型組相比，各治療組兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織IL-10表達(dá)明顯增(P<0.05，P<0.01)，軟骨細(xì)胞組和支架復(fù)合軟骨細(xì)胞組兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織IL-22、TGF-β1表達(dá)明顯減少(P<0.05，P<0.01)；見表1和圖2。

圖1 各組兔膝關(guān)節(jié)滑膜HE染色(×400)

組別IL-10IL-22TGF-β1正常組53.5±10.12)43.6±10.42)21.7±7.12)模型組17.2±4.777.5±17.651.5±11.9軟骨細(xì)胞組32.1±13.22)57.6±16.81)29.6±9.32)支架組23.4±3.91)63.1±15.126.5±11.12)支架復(fù)合軟骨細(xì)胞組31.6±8.32)47.1±13.72)44.5±9.5

與模型組比較：1)P<0.05,2)P<0.01

圖2 各組兔膝關(guān)節(jié)滑膜IL-10、IL-22、TGF-β1免疫組化檢測(cè)結(jié)果(×400)

3 討 論

支架材料作為細(xì)胞相互作用的模板和細(xì)胞外基質(zhì)的形成，為新形成的組織提供結(jié)構(gòu)支持；以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為種子細(xì)胞具有多向分化潛能，取材簡(jiǎn)單，易分離，低免疫原性等特點(diǎn)，具有分化為軟骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞等骨組織細(xì)胞的能力；細(xì)胞生長(zhǎng)因子(如TGF-β)能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化和缺損處骨組織愈合的作用〔9〕。支架結(jié)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程技術(shù)在修復(fù)骨組織缺損方面已開展應(yīng)用〔10〕。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了組織工程在治療RA上有良好的應(yīng)用前景。

RA的主要病理改變?yōu)榛ぱ祝憩F(xiàn)為滑膜增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。Th17細(xì)胞在關(guān)節(jié)滑膜中主要分泌IL-17、IL-22、TFN-α等促炎因子，Treg細(xì)胞參與免疫應(yīng)答的調(diào)控，主要分泌IL-10、TGF-β1等抗炎因子，通過抑制自身反應(yīng)的淋巴細(xì)胞，維持機(jī)體免疫耐受，抑制炎性反應(yīng)。周大兵等〔11〕發(fā)現(xiàn)IL-17在RA滑膜組織中的表達(dá)明顯升高，IL-10在RA滑膜組織中的表達(dá)相對(duì)降低，且二者具有相關(guān)性，提示IL-17/IL-10平衡失調(diào)在RA的發(fā)病機(jī)制中具有一定作用。王秋燚等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)IL-17通過相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從多個(gè)方面對(duì)RA發(fā)揮致病作用。

IL-10不僅能夠預(yù)防關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，還可抑制關(guān)節(jié)炎的發(fā)展，在RA的發(fā)病過程中具有保護(hù)作用。可由肝細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等分泌，可抑制IL-1、TNF-α等促炎因子表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用。IL-22屬IL-10細(xì)胞因子家族成員，可由多種免疫細(xì)胞分泌產(chǎn)生，如Th1、Th22、Th17。在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)實(shí)驗(yàn)中，IL-22同時(shí)誘導(dǎo)促炎因子和抗炎因子產(chǎn)生，IL-22對(duì)早期關(guān)節(jié)炎有保護(hù)作用，其機(jī)制與增加IL-10水平有關(guān)〔13〕，提示IL-22在關(guān)節(jié)炎中具有保護(hù)及致病雙重作用，取決于疾病發(fā)展的不同階段。研究發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)滑膜IL-22水平提高，與疾病活動(dòng)性及骨破壞相關(guān)，可成為評(píng)估病情與骨破壞的指標(biāo)〔14〕，提示IL-22有望成為RA治療的新靶點(diǎn)。TGF-β超家族成員調(diào)節(jié)著多種細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)展過程包括細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡、血管生長(zhǎng)、細(xì)胞外的相互作用及免疫反應(yīng)等〔15〕。TGF-β1是一種有雙向調(diào)節(jié)能力的細(xì)胞因子，TGF-β1單獨(dú)作用時(shí)，可誘導(dǎo)初始T細(xì)胞分化為Treg細(xì)胞，而在TGF-β1和IL-6的共同作用下可誘導(dǎo)初始T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞，TGF-β1作為一種雙向調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子，作用復(fù)雜，可能涉及RA的病程長(zhǎng)短和病情活動(dòng)度。陳瑞林等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)RA患者外周血中Treg細(xì)胞占CD4+T 細(xì)胞的百分率顯著低于健康對(duì)照者，且血清中TGF-β1的表達(dá)顯著高于健康對(duì)照者。

綜上，海藻酸鈉支架復(fù)合組織工程化軟骨細(xì)胞抗炎機(jī)制可能是通過上調(diào)滑膜IL-10表達(dá)，下調(diào)IL-22和TGF-β1表達(dá)起抗炎作用的。由于上述細(xì)胞因子的產(chǎn)生涉及多條細(xì)胞信號(hào)通路，因此，海藻酸鈉支架復(fù)合組織工程化軟骨細(xì)胞抗炎的具體機(jī)制與細(xì)胞因子之間是如何發(fā)揮作用的及細(xì)胞因子之間平衡失調(diào)對(duì)RA的發(fā)生發(fā)展有何影響，有待進(jìn)一步研究。