沉默ATAD2增加乳腺癌細胞放療敏感性

任瀟毅 宋寧寧 陳建中 張東銘 鄭英斌

(鄭州大學第二附屬醫院 1乳腺外科，河南 鄭州 450000；2內分泌科；3普外科)

乳腺癌是常見于女性的實體腫瘤，其中手術治療和放射治療是局部控制乳腺癌的主要途徑，放射治療是乳房功能保守性手術后治療的關鍵，提高乳腺癌細胞放射敏感性也成為廣大醫學工作者探討的重點〔1〕。隨著人們對乳腺癌發病機制的不斷研究，靶向基因提高腫瘤細胞放射敏感性對于腫瘤的治療具有重要意義〔2〕。三磷酸腺苷酶家族蛋白(ATAD)2是一種原癌基因，其在惡性腫瘤或低分化組織中高表達，在分化成熟的組織中表達水平極低，ATAD2可以調控多種分子的轉錄和表達，是核內激素受體的激活分子，其異常表達于多種腫瘤組織中，并且與腫瘤細胞的生長凋亡有關〔3，4〕。研究表明，ATAD2在乳腺癌組織中陽性表達率高于癌旁組織，ATAD2在乳腺癌的發生發展中具有重要意義〔5〕。本實驗探討沉默ATAD2對乳腺癌細胞增殖凋亡及放射敏感性的影響，為延長乳腺癌患者的生存期提供參考依據。

1 材料與方法

1.1材料 乳腺癌細胞MDA-MB-231購自北京伯樂生命科學發展有限公司；Realtime PCR試劑購自美國Thermo Fisher Scientific；陰性對照慢病毒和ATAD2 shRNA慢病毒購自南京科佰生物科技有限公司；兔抗激活型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-3抗體、兔抗p21抗體購自北京百奧萊博科技有限公司；膜聯蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒購自杭州聯科生物技術股份有限公司；PI單染細胞周期檢測試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司；兔抗細胞周期依賴性蛋白激酶(CDK)4抗體、ATAD2抗體購自美國Novus Biologicals。

1.2細胞轉染 乳腺癌細胞生長密度為40%～50%以后，將慢病毒液添加至細胞中，感染復數為20，培養12 h以后換液，繼續培養3 d以后，用0.5 μg/ml的嘌呤霉素篩選2 w。設置轉染陰性對照慢病毒的乳腺癌細胞為Lv-NC組，設置轉染ATAD2 shRNA慢病毒的乳腺癌細胞為Lv-ATAD2 shRNA組。

1.3沉默效果檢測 Realtime PCR：取Lv-NC組、Lv-ATAD2 shRNA組細胞，用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)將細胞洗滌2次以后，依次添加1 ml的TRIZOL裂解液，提取細胞中總RNA。配制10 μl的逆轉錄體系，體系中包括：0.5 μl隨機引物、2 μl 5×Primescript TM緩沖液、5.5 μl不含核糖核酸酶的水、0.5 μl Primescript TM RT Enyme mix、0.5 μl Oligo dT Primer、1 μl RNA，cDNA反應條件為：37℃，15 min；85℃，5 s。Realtime PCR體系為：3 μl滅菌蒸餾水、5 μl SYBR premix Ex Taq、0.5 μl上下游引物、1 μl cDNA。Realtime PCR條件為：95℃，10 s；95℃ 5 s；57℃20 s；95℃ 10 s，共40個循環。根據每個反應的Ct值計算ATAD2 mRNA的水平，設置甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為參照。ATAD2上游引物：5′-GGAATCCCAAACCACTGGACA-3′，下游引物5′-GGTAGCGTCGTCGTAAAGCACA-3′。GAPDH上游引物：5′-ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC-3′，下游引物5′-CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3′。Western印跡法：取Lv-NC組、Lv-ATAD2 shRNA組細胞，用RIPA裂解液提取細胞中的總蛋白。依照二喹啉甲酸(BCA)法對蛋白進行定量檢測以后，把蛋白樣品與5×上樣緩沖溶液混合后，煮沸5 min。配制5%的濃縮膠和10%的分離膠，依照每孔中添加50 μg蛋白樣品計算，把蛋白樣品分別添加至上樣孔中，進行電泳。電壓設置為80 V，電泳時間2 h后，觀察溴酚藍進入到凝膠的底部方可終止電泳。取出凝膠，以自來水沖洗以后，進行轉膜，轉膜電流為80 mA，轉膜時間為60 min。轉膜后的硝酸纖維素(NC)膜置于含有5%牛血清白蛋白反應液中結合反應2 h以后，再將NC膜放在一抗、二抗反應液中反應2 h，一抗用封閉液按照1∶1 000稀釋，二抗用封閉液按照1∶4 000稀釋。用電化學發光(ECL)試劑顯色。分析每組ATAD2和內參GAPDH條帶的灰度值，并以ATAD2灰度值與GAPDH灰度值的比值表示ATAD2蛋白水平。

1.4細胞分組和照射方法 Lv-NC、Lv-ATAD2 shRNA細胞分別用8 Gy劑量照射處理，記為Lv-NC+放射組、ATAD2 shRNA+放射組。照射方法為：美國VarianClinac ix直線加速器，劑量率為300 cGy/min，100 cm源皮距、20 cm×20 cm的照射野，6MV X射線。

1.5噻唑藍(MTT)法檢測細胞增殖 乳腺癌細胞接種在96孔細胞培養板中，按照Lv-NC、Lv-ATAD2 shRNA、Lv-NC+放射、ATAD2 shRNA+放射細胞分組方法處理以后，繼續培養24 h，在每個孔中添加20 μl的MTT溶液，繼續孵育4 h以后，將孔內的液體吸棄，繼續添加二甲基亞砜(DMSO)溶液150 μl，放在搖床上反應10 min，測定490 nm每孔的吸光度值。

1.6PI單染法檢測細胞周期 Lv-NC、Lv-ATAD2 shRNA、Lv-NC+放射、ATAD2 shRNA+放射細胞按照上述方法處理以后，繼續培養24 h，在細胞中添加PBS將細胞洗滌以后，用0.25%的胰蛋白酶消化，將細胞配制成單細胞懸浮液。添加75%的乙醇溶液混合后，放置于4℃孵育過夜。在細胞中添加RNase A水，放在37℃孵育30 min，繼續添加PI染液400 μl染色30 min。流式細胞儀檢測細胞周期變化。

1.7Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡 Lv-NC、Lv-ATAD2 shRNA、Lv-NC+放射、ATAD2 shRNA+放射細胞按照上述方法處理以后，繼續培養24 h，收集各組細胞，用PBS懸浮以后，再分別添加5 μl的Annexin V-FITC和PI染液反應10 min，上流式細胞儀檢測凋亡變化。

1.8Western印跡檢測細胞中Cleaved Caspase-3、CDK4、p21蛋白表達水平 Lv-NC、Lv-ATAD2 shRNA、Lv-NC+放射、ATAD2 shRNA+放射細胞按照上述方法處理以后，繼續培養24 h，收集各組細胞，用Western印跡方法檢測細胞中Cleaved Caspase-3、CDK4、p21蛋白表達水平，步驟同上。

1.9克隆形成實驗檢測放射敏感性 Lv-NC、Lv-ATAD2 shRNA分別經過劑量為0、2、4、6、8 Gy的X射線照射處理以后，接種到6 cm的培養皿中，每個培養皿中添加300個細胞，同時在培養皿內添加4 ml細胞培養液。放在37℃孵育培養2 w以后，肉眼可觀察到培養皿中有細胞克隆出現。把上清吸棄掉，添加PBS洗3次，繼續添加5 ml的甲醇溶液固定15 min，用結晶紫染色20 min后，放在流水中將染液洗掉，置于室溫條件中干燥。計數克隆數目，用GraphadPad擬合細胞存活曲線，根據單擊多靶模型計算出放射敏感性的參數值：平均致死劑量(D0)、準閾劑量(Dq)、外推數(N)、2 Gy照射劑量細胞存活系數(SF2)、參數值(k)，計算放射增敏比。

1.10統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1ATAD2 shRNA轉染后乳腺癌細胞中ATAD2蛋白表達水平 乳腺癌細胞中轉染ATAD2 shRNA慢病毒后，細胞中ATAD2 mRNA和蛋白水平均顯著降低(P<0.05)。見圖1、表1。

2.2沉默ATAD2協同放療抑制乳腺癌細胞增殖 沉默ATAD2后的乳腺癌細胞存活率顯著降低(P<0.05)，放射治療后的乳腺癌細胞的存活率也顯著降低(P<0.05)，并且沉默ATAD2和放射治療具有協同抑制乳腺癌細胞生長的作用。見表2。

圖1 Western印跡測定ATAD2 shRNA慢病毒對乳腺癌細胞中ATAD2蛋白表達影響

組別ATAD2 mRNAATAD2蛋白Lv-NC組1.00±0.000.84±0.09Lv-ATAD2 shRNA組0.35±0.061)0.38±0.051)

與Lv-NC組比較:1)P<0.05

2.3沉默ATAD2協同放射治療將乳腺癌細胞周期阻滯在G0/G1期并誘導細胞凋亡 從表2和圖2中可以看出，沉默ATAD2后的乳腺癌細胞G0/G1期比例升高，放射治療后的乳腺癌細胞G0/G1期比例也升高，并且沉默ATAD2和放射治療具有協同抑制乳腺癌細胞周期的作用；沉默ATAD2和放射治療均可以誘導乳腺癌細胞凋亡，并且二者具有協同作用。

表2 下調ATAD2后乳腺癌細胞周期分布、細胞存活率及凋亡率變化

與Lv-NC組比較:1)P<0.05；與ATAD2 shRNA+放射組比較：2)P<0.05；表3、4同

圖2 流式細胞術檢測下調ATAD2對乳腺癌細胞凋亡影響

2.4沉默ATAD2協同放射治療促進乳腺癌細胞中Caspase蛋白活化和p21蛋白表達，同時下調細胞中CDK4蛋白表達水平 從表3和圖3中可以看出，沉默ATAD2后的乳腺癌細胞中Cleaved Caspase-3、p21蛋白水平顯著升高，CDK4蛋白水平顯著降低，放射治療后的乳腺癌細胞中Cleaved Caspase-3、p21蛋白水平也顯著升高，CDK4蛋白水平也顯著降低，并且沉默ATAD2和放射治療具有協同作用。

2.5沉默ATAD2提高乳腺癌細胞放射敏感性 與Lv-NC組比較，Lv-ATAD2 shRNA組、2、4、6、8 Gy細胞存活分數顯著下降(P<0.05)。沉默ATAD2后的乳腺癌細胞放射增敏比為1.396。見表4、表5。

表3 下調ATAD2后乳腺癌細胞中Cleaved Caspase-3、CDK4、p21蛋白表達水平變化

1～4：Lv-NC組、Lv-ATAD2 shRNA組、Lv-NC+放射組、ATAD2 shRNA+放射組圖3 Western印跡檢測下調ATAD2對乳腺癌細胞中Cleaved Caspase-3、CDK4及p21蛋白表達影響

表4 不同放射劑量兩組細胞存活分數

表5 單擊多靶模型參數值

3 討 論

ATAD2基因定位于8q24.13染色體上，其編碼的蛋白質又稱為PRO2000或ANCCA，ATAD2蛋白中含有可以調控細胞活性的ATP酶結構域、溴結構域，ATAD2蛋白的氨基端還含有雄激素受體、雌激素受體等協同因子，能夠共同調控下游靶基因的轉錄和表達〔6～8〕。ATAD2在乳腺癌、宮頸癌、肝癌、淋巴瘤等腫瘤組織中高表達，其在腫瘤中發揮癌基因的作用，ATAD2可以通過調控多種癌癥相關基因、腫瘤細胞表觀遺傳等影響腫瘤細胞的生長、凋亡〔5，6，9，10〕。ATAD2敲減可以誘導宮頸癌細胞凋亡，抑制宮頸癌細胞生長，后續在多種腫瘤細胞中證實敲減ATAD2具有抗腫瘤作用〔6，9〕。本研究表明，沉默ATAD2后的乳腺癌細胞的增殖能力降低，細胞凋亡率升高，沉默ATAD2在乳腺癌細胞中發揮抑制作用。

研究證實，沉默ATAD2發揮抗腫瘤細胞生長機制與阻礙細胞周期進展的和抑制Caspase凋亡反應有關；在結腸癌、宮頸癌細胞中的研究表明，沉默ATAD2可以將細胞周期阻滯在G0/G1期，也有研究表明，沉默ATAD2對腫瘤細胞周期沒有明顯作用；在肝癌等腫瘤細胞中的研究顯示，沉默ATAD2可以激活細胞中Caspase-3，誘導細胞凋亡發生〔6，11～13〕。Caspase-3是Caspase蛋白家族的成員之一，其在Caspase凋亡反應中發揮執行者的作用，Caspase-3只有被活化后才可以誘導細胞凋亡的發生〔14〕。CDK4是一種細胞周期促進因子，其可以誘導細胞從G0/G1期向S期進展，p21是一種細胞周期抑制因子，其表達水平升高后可以抑制細胞周期進展〔15〕。本研究顯示，沉默ATAD2后的乳腺癌細胞中Caspase-3活化水平升高，細胞中p21蛋白水平升高，CDK4蛋白水平下降，細胞周期被阻滯在G0/G1期，沉默ATAD2可以通過激活Caspase凋亡反應和通過調控細胞周期因子的表達發揮抗乳腺癌的作用。

流行病學資料顯示，乳腺癌的發生率呈不斷上升趨勢，隨著人們對乳腺癌生物學行為的不斷研究發現，擴大手術切除范圍并不能達到較好的治療效果，保乳手術也成為乳腺癌治療的首選，放射治療是目前除了手術治療之外的最常見的腫瘤治療手段，在多種腫瘤的治療中廣泛應用，放射治療也是手術切除后保乳治療的首選途徑〔16～18〕。研究顯示，腫瘤細胞對于放射治療的敏感性差是導致放療失敗的重要原因，尋找有效的途徑提高腫瘤細胞的放射敏感性已經成為目前腫瘤治療的關鍵〔19〕。本研究結果表明，沉默ATAD2在誘導乳腺癌細胞凋亡和抑制乳腺癌細胞增殖的過程中還可以提高乳腺癌細胞放射敏感性，靶向ATAD2可能是提高乳腺癌細胞放射敏感性的有效途徑之一。

總之，沉默ATAD2可能是提高乳腺癌放射敏感性的潛在途徑，沉默ATAD2能夠協同放射治療誘導乳腺癌細胞凋亡并阻滯細胞周期，發揮抗腫瘤作用。目前對于ATAD2具體的調控機制尚不明確，對于沉默ATAD2在體內抗乳腺癌的作用尚不清楚，在以后的實驗探討中會對上述部分進行探索。