加載促生長激素神經肽的介孔二氧化硅納米顆粒藥物載體對高糖環境下神經元細胞增殖的影響

段 淏 趙玉武

近年來糖尿病的發病率不斷升高，隨之而來的糖尿病神經病變發病率也急劇升高，嚴重影響了患者的生活質量。高血糖是造成糖尿病神經病變的主要誘因[1]，其原因主要是高濃度的葡萄糖會導致神經元損傷[2]。已有研究證實，長期高血糖可引起背根神經節(DRG)神經元損傷[3-4]，影響體外DRG神經元的軸突生長，可導致細胞內活性氧(ROS)、線粒體功能障礙，甚至引起細胞凋亡[5]。促生長激素神經肽(GAL)不僅參與體內血糖和能量的調節，對多種類型的細胞外損傷亦具有神經保護作用[6]。Xu等[7]應用體外培養的高葡萄糖濃度處理的DRG神經元模型，研究了GAL對DRG神經元細胞內ROS表達、細胞活力和凋亡，以及GAL及其受體(GALR1和GALR2)表達的影響。結果表明，外源性GAL抑制了高葡萄糖引起的不良效應，具有明顯的神經保護作用。有序介孔二氧化硅納米顆粒(MSNs)具有很好的生物相容性、較高的藥物加載量和很好的藥物緩釋性能，其介孔結構對于多肽藥物具有很好的保護作用[8-10]。本研究首先制備了由聚乙二醇(PEG)修飾的生物相容性高、載藥量大、緩釋能力強的MSNs(MSNs/PEG)藥物載體，隨后加載GAL制備MSNs/GAL/PEG藥物載體，研究后者對高糖環境下DRG神經元細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 MSNs的合成和樣品表征 將0.862 4 g十六烷基三甲溴化銨(CTAB)溶入149.5 g去離子水中，再加入25 mL乙二醇和7.2 mL NH3·H2O溶液，50 ℃下攪拌0.5 h，逐滴加入1 mL正硅酸乙酯(TEOS)。50 ℃下攪拌2 h，然后轉入到反應釜在100 ℃烘箱水中熱處理24 h。10 000×g離心15 min，經無水乙醇和去離子水洗滌數次后，置于60 ℃真空干燥箱中干燥。采用酸醇萃取法除去CTAB后，將樣品置于60 ℃真空干燥箱中干燥。使用場發射掃描電子顯微鏡(FE-SEM，型號為S-4800，日本電子株式會社)和透射電子顯微鏡(型號為JEM-2100F，日本電子株式會社)進行樣品表征，加速電壓分別為5和200 kV。

1.2 制備MSNs/PEG并進行生物相容性檢測 將溶解在10 mL DMSO的80 mg甲氧基PEG琥珀酰亞胺碳酸酯(mPEG-SC)加入合成的MSNs/氨基(NH2) DMSO溶液中，室溫下持續攪拌12 h。離心收集沉淀，用無水乙醇洗4次除去殘留的PEG，隨后真空干燥。分別用200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 和0 μg/mL的MSNs/PEG處理DRG神經元細胞24和48 h，采用CCK-8(cell counting kit-8)細胞活性檢測法檢測其細胞活性。

1.3 制備MSNs/GAL/PEG并測定GAL的加載量 將制備成功的40 mg MSNs/PEG溶解到15 mL PBS中，用攪拌和超聲的方法使其分散均勻，隨后與2 mL質量濃度為1 mg/mL的含GAL的PBS溶液混合后，在室溫下攪拌12 h。10 000×g離心收集沉淀得到加載了GAL的MSNs/PEG(MSNs/GAL/PEG)，并用PBS洗3次后于室溫下真空干燥過夜。在加載前后的GAL溶液中，使用甘丙肽ELISA試劑盒測定MSNs/GAL/PEG中GAL的加載量。

1.4 MSNs/GAL/PEG的緩釋性能測試 通過半透膜外部GAL質量濃度的變化來檢測體外MSNs/PEG藥物載體對GAL的緩釋性能。實驗具體操作方法：10 mg制備好的MSNs/GAL/PEG分散在4 mL PBS(pH值7.4)中，通過攪拌和超聲處理使其完全分散。隨后，將其放入預先處理好的透析袋中，并將透析袋浸透在6 mL PBS中，37 ℃下緩慢攪拌，分別于1、2、4、6、8、10、12、24、36、48、72 h各時間點取出4 mL透析袋外側的溶液，使用甘丙肽ELISA試劑盒測定GAL的質量濃度。

1.5 MSNs/GAL/PEG對高糖環境下DRG神經元細胞增殖的影響 分析MSNs/GAL/PEG納米藥物載體對高糖環境下DRG神經元細胞增殖的影響，具體操作方法：在孕15 d的Wistar大鼠(購自上海斯萊克實驗動物有限公司)胚胎中分離得到DRG神經元細胞，用0.25%胰蛋白酶和0.3 mg/mLⅠ型膠原酶在37 ℃下消化DRG神經元細胞10 min。隨后加入FBS至10%以停止消化，1 000×g離心后收集細胞。將細胞重懸于神經基礎培養基中[含有2% B-27補充劑，10 ng/mL神經生長因子(NGF)和1 mmol/LL-谷氨酰胺]，并使用無菌改良巴斯德玻璃吸管研磨，用130 目過濾器過濾細胞，然后計數。在神經基底細胞培養基中，葡萄糖濃度為25 mmol/L時對DRG神經元細胞的存活和生長最為有利，因此本研究將此葡萄糖濃度稱為正常，并用于對照組。高糖組、高糖+MSNs/PEG組和高糖+MSNs/GAL/PEG組的培養基中均添加最終濃度為45 mmol/L的葡萄糖。培養12、24、48、36、60和72 h后，采用CCK-8測定各組DRG神經元細胞的細胞數。

2 結 果

2.1 合成的MSNs 樣品表征結果顯示，合成的MSNs的形貌為球形，粒徑均勻，粒徑為90～120 nm。合成的MSNs粒徑均一，孔徑分布良好。見圖1。

A、B 透射電子顯微鏡表征圖像 C FE-SEM表征圖像圖1 不同放大比例和不同電子顯微鏡下粒徑為100 nm的MSNs納米顆粒的表征圖像

2.2 MSNs/PEG生物相容性檢測 用200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 和0 μg/mL的MSNs/PEG處理DRG神經元細胞24 h后的細胞活性分別為99.60%±3.29%、98.95%±1.17%、96.99%±0.68%、105.80%±0.39%、103.20%±1.57%、100.92%±2.08%、102.49%±8.85%、107.72%±6.34%，48 h后的細胞活性分別為94.48%±0.84%、95.45%±1.29%、94.32%±1.22%、94.32%±1.41%、94.00%±1.94%、95.13%±1.84%、94.00%±2.23%、99.03%±2.02%。結果表明，在0～200 μg/mL的質量濃度范圍內，MSNs/PEG對神經元細胞均無毒性。

2.3 MSNs/GAL/PEG中GAL的加載量測定 ELISA法檢測結果顯示，每毫克MSNs/GAL/PEG中GAL的加載量為3.26 μg。

2.4 MSNs/GAL/PEG的緩釋性能測試 緩釋性能測試結果顯示，1、2、4、6、8、10、12、24、36、48、72 h后，MSNs/GAL/PEG半透膜外部GAL質量濃度分別為(3.58±1.46)、(10.77±1.11)、(54.80±2.32)、(61.70±2.58)、(63.67±2.52)、(66.61±1.37)、(66.82±2.00)、(67.55±2.02)、(69.80±1.76)、(69.64±3.73)、(71.57±3.70) ng/mL。結果表明，在pH值7.4、37 ℃的條件下，該藥物載體在0～10 h之間有一個快速釋放GAL的過程，10 h 后GAL的質量濃度一直維持在恒定的范圍內。

2.5 MSNs/GAL/PEG對高糖環境下DRG神經元細胞增殖的影響 培養12、24、48、36、60和72 h后，對照組的神經基底細胞培養基中DRG神經元細胞的細胞數分別為(62.69±5.97)×104、(68.56±3.34)×104、(87.91±6.80)×104、(141.25±16.34)×104、(183.78±12.02)×104、(265.45±7.19)×104，高糖組中分別為(55.71±1.23)×104、(52.77±8.39)×104、(58.61±12.21)×104、(66.59±7.41)×104、(77.59±4.02)×104、(114.37±13.27)×104，高糖+MSNs/PEG組中分別為(58.05±13.96)×104、(55.81±4.67)×104、(63.61±11.46)×104、(68.6±4.84)×104、(77.00±7.02)×104、(115.86±8.76)×104，高糖+MSNs/GAL/PEG組中分別為(60.82±2.87)×104、(63.16±0.72)×104、(84.69±16.35)×104、(127.59±12.12)×104、(164.29±8.21)×104、(241.93±20.88)×104。高糖+MSNs/GAL/PEG組培養36、48、60、72 h后的DRG神經元細胞數均顯著多于高糖組和高糖+MSNs/PEG組同時間點(P值均<0.05)，但與對照組各時間點間的差異均無統計學意義(P值均>0.05)。結果表明，MSNs/GAL/PEG納米藥物載體可以明顯加快高糖環境下DRG神經元細胞的增殖。

3 討 論

糖尿病周圍神經病變的機制目前尚未明確，神經缺血、糖還原酶的激活、氧化應激損傷、自身免疫和神經營養因子減少均可能參與了疾病的發生和發展，而能夠將血糖控制在理想水平是減少糖尿病合并周圍神經病變的基礎[11]。研究[11]結果表明，糖尿病患者易發生氧化應激，在血糖水平急劇波動或持續高血糖的狀態下，機體可以通過糖化氧化或自氧化作用使糖尿病患者體內產生大量的ROS，導致細胞內線粒體DNA的損傷。

GAL被稱為神經元肽，廣泛分布于哺乳動物的中樞和周圍神經系統，具有多種生物學效應，包括心理調節、能量平衡，調節胰島素分泌，以及影響神經元損傷、生存和再生等神經保護作用[12]。研究[13]結果表明，GAL對多種細胞外損傷刺激具有神經保護作用。提示，GAL對于治療糖尿病神經病變具有很大的臨床應用潛力。

蛋白和多肽類藥物在體內容易降解，因此，如何構建具有良好生物相容性、緩釋效果好、對蛋白多肽藥物具有保護作用的藥物載體是這類藥物臨床應用的關鍵。無機納米材料具有結構穩定、粒子大小和形態易于控制、易于表面功能化等方面的優勢，且具有獨特的光學、磁學、電學和物理學性能，近年來在化學藥物、DNA和蛋白質等傳遞方面的應用越來越受到重視[14]。MSNs作為一種新型材料，其特定的介孔結構、穩定的性質和良好的可塑性，表現出了較傳統藥物納米載體無可比擬的優越性，成為潛在的新型藥物傳遞系統材料[15]。MSNs是一種粒徑為10～600 nm、孔徑為2～50 nm的二氧化硅粒子，具有較大的比表面積，較高的比孔容和載藥量，均一、可調的孔徑，以及較好的生物相容性[19]，其在體內可生物降解，降解產物硅酸可被人體吸收，也可經泌尿系統排泄。Lee等[16]研究結果顯示，0.1 mg/mL的MSNs在體外模擬體液中7 d內即可完全降解。MSNs已成為近年來極具潛力的藥物載體。

本研究首先構建了生物相容性高、載藥量大、緩釋能力強的MSNs/PEG藥物載體，隨后在MSNs中加載GAL制備MSNs/GAL/PEG藥物載體，應用高葡萄糖濃度處理的DRG神經元體外培養模型，采用CCK-8細胞活性檢測法評價MSNs/GAL/PEG藥物載體對高糖環境下DRG神經元細胞增殖的影響。本研究構建的MSNs粒徑為90～120 nm，介孔形貌均一。MSNs/PEG具有極高的生物相容性，在0～200 μg/mL質量濃度的范圍內，MSNs/PEG對神經元細胞均無毒性。每毫克MSNs/GAL/PEG中GAL的加載量為3.26 μg，提示其具有較高的GAL加載能力。緩釋性能優異的藥物載體可以長時間緩慢地釋放藥物，減少藥物降解，降低局部藥物濃度，改善藥物不良反應，提高藥物利用率。本研究結果顯示，MSNs/GAL/PEG藥物載體在0～10 h之間有一個快速釋放GAL的過程，10 h后GAL的質量濃度一直維持在恒定的范圍內；提示，本研究所構建的MSNs/PEG納米藥物載體對GAL具有良好的緩釋性能。高糖環境會造成DRG神經元細胞損傷，直接的表現就是細胞增殖受到抑制。本研究結果證實，MSNs/GAL/PEG藥物載體可以明顯加快高糖環境下DRG神經元細胞的增殖，顯著改善高糖環境對DRG神經元細胞的影響。

本研究探索構建MSNs作為GAL的載體，具有非常大的潛在應用價值，為進一步的動物實驗和臨床藥物研究提供了必要的實驗基礎，其毒理學和藥理學研究也為藥物的臨床研究提供了具有重要價值的實驗資料。