秦艽藥材與飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量傳遞性研究

吳明澤，劉國(guó)飛，王笑，李婷，王常瞵，高鵬，代龍*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,山東 濟(jì)南 250355;2.山東禹澤藥康產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司，山東 德州 251200)

秦艽是我國(guó)重要的傳統(tǒng)中藥之一，具有祛風(fēng)濕、清濕熱、止痹痛、退虛熱的作用，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品[1]。秦艽(GentianamacrophyllaPall.)屬于龍膽科(Gentianaceae)龍膽屬(Gentiana(Tourn.) L.) 植物[2]。現(xiàn)代研究表明，秦艽主要含有環(huán)烯醚萜苷類(lèi)、木脂素類(lèi)、黃酮類(lèi)、三萜類(lèi)等化學(xué)成分，具有抗炎鎮(zhèn)痛、保護(hù)肝臟、免疫抑制、降血壓、保護(hù)腦組織、抗流感病毒、抗腫瘤等藥理作用[3]。其中龍膽苦苷和馬錢(qián)苷酸在藥材中含量較高，2015版《中國(guó)藥典》將這兩個(gè)成分作為藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)成分。現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果顯示，除龍膽苦苷、馬錢(qián)苷酸之外，其他多種環(huán)烯醚萜類(lèi)成分也具有良好的藥理活性，獐牙菜苦苷、獐牙菜苷以及6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷均對(duì)fMLP誘導(dǎo)產(chǎn)生的超氧化物的生成有抑制作用[4]。所以，本實(shí)驗(yàn)對(duì)馬錢(qián)苷酸、龍膽苦苷進(jìn)行含量測(cè)定，在指紋圖譜中指認(rèn)馬錢(qián)苷酸、獐牙菜苦苷、6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷5種成分，對(duì)秦艽藥材及飲片進(jìn)行質(zhì)量控制。

2019年3月，《古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑物質(zhì)基準(zhǔn)的申報(bào)資料要求(征求意見(jiàn)稿)》[5]中提出了藥材、飲片和對(duì)應(yīng)實(shí)物標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)控項(xiàng)目之間應(yīng)具有較好的相關(guān)性。應(yīng)以浸出物(出膏率)、含量測(cè)定、指紋圖譜等指標(biāo)，全面考察藥材-飲片-中間體-對(duì)應(yīng)實(shí)物的相關(guān)性，即質(zhì)量傳遞性。

中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下以臨床實(shí)際應(yīng)用為參考，使用現(xiàn)代中藥提取方法并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化工藝規(guī)程制備而成的單味中藥飲片水煎液。標(biāo)準(zhǔn)湯劑可以標(biāo)化以水為溶媒的新型用藥形式，較大程度上解決了中藥配方顆粒等新型用藥形式與臨床中藥湯劑間存在質(zhì)量和療效差異的問(wèn)題。在國(guó)家出臺(tái)的《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求(征求意見(jiàn)稿)》中則明確要求有關(guān)中藥配方顆粒的所有研究均應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行對(duì)比研究[6-8]。秦艽飲片炮制方法為除雜、洗凈、潤(rùn)透、切厚片、干燥，因此，本實(shí)驗(yàn)將藥材與飲片炮制方法相結(jié)合，將藥材干切至飲片狀，按照標(biāo)準(zhǔn)湯劑煎煮，與飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行比較，為經(jīng)典名方中藥材、飲片的質(zhì)量傳遞性提供了一定的研究基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)擬建立同時(shí)適合于秦艽藥材、飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的指紋圖譜，并結(jié)合含量測(cè)定、出膏率，進(jìn)行秦艽的藥材、飲片質(zhì)量傳遞性研究，為秦艽的質(zhì)量控制以及中藥配方顆粒和經(jīng)典名方研究提供借鑒。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20A高效液相色譜儀(日本株式會(huì)社島津制作所，含Labsolution色譜工作站))；XS105型1/10萬(wàn)電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；KQ-500DV超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TDl-5-A離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；KDM型可調(diào)控溫電熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司)。

1.2 試藥

15批秦艽藥材購(gòu)自不同產(chǎn)地，詳見(jiàn)表1，經(jīng)濟(jì)南市藥品檢驗(yàn)所主任藥師宋希貴鑒定，為龍膽科植物秦艽GentianamacrophyllaPall.的干燥根。經(jīng)檢驗(yàn)，均符合2015年版《中國(guó)藥典》秦艽項(xiàng)下的各項(xiàng)規(guī)定。15批秦艽飲片為上述15批藥材按照藥典標(biāo)準(zhǔn)炮制所得[2]，均為實(shí)驗(yàn)室自制。對(duì)照品龍膽苦苷(批號(hào) 110770-201716，w≥97.6%)、馬錢(qián)苷酸(批號(hào)111865-201704，w≥97.4%)、獐牙菜苦苷(批號(hào)110785-201404，w≥98.3%)購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；獐牙菜苷(批號(hào)PN1125SA13，w≥98%)、6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷(批號(hào)P26M6S1，w≥98%)購(gòu)于上海源葉生物技術(shù)有限公司；水為娃哈哈純凈水，乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

表1 秦艽藥材信息

2 方法與結(jié)果

2.1 秦艽藥材、飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備

依據(jù)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》[9]及《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求(征求意見(jiàn)稿)》[10]中相關(guān)規(guī)定，確定工藝：稱(chēng)取干切至飲片狀的藥材(無(wú)洗、潤(rùn)步驟，直接干切)、飲片各100 g，加7倍量水浸泡30 min，加熱回流30 min，趁熱200目濾布過(guò)濾；藥渣再加6倍量水，加熱回流20 min，趁熱過(guò)濾，合并兩次濾液，備用。按此法制備秦艽藥材、飲片各15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑[11]。

2.2 HPLC指紋圖譜的研究

2.2.1 供試品溶液的制備

取藥材、飲片各15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑，取3 mL標(biāo)準(zhǔn)湯劑加甲醇定容至10 mL，5000 r/min離心5 min，取上清液，過(guò)0.22 μm的微孔濾膜，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

取馬錢(qián)苷酸、獐牙菜苦苷、6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.399 3 mg/mL、0.104 1 mg/mL、0.251 0 mg/mL、0.477 6 mg/mL、0.236 2 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 色譜條件

Cosmosil C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流動(dòng)相乙腈(A)-0.1%醋酸(B)，梯度洗脫(0～60 min，3%～15%A)；柱溫30 ℃；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

2.2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

取秦艽藥材標(biāo)準(zhǔn)湯劑(S5)按2.2.1項(xiàng)下制備方法制備樣品，按2.2.3項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，以龍膽苦苷色譜峰為參照峰，計(jì)算得各共有峰的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于等于3.0%、相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于等于5.0%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取秦艽藥材標(biāo)準(zhǔn)湯劑(S5)6份，按2.2.1項(xiàng)下制備方法平行制備6份樣品，按2.2.3項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。以龍膽苦苷色譜峰為參照峰，計(jì)算得各共有峰的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于等于3.0%、相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于等于5.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取秦艽藥材標(biāo)準(zhǔn)湯劑(S5)，按2.2.1項(xiàng)下制備方法制備樣品，按2.2.3項(xiàng)下色譜條件分別在0、4、8、12、16、20、24 h時(shí)測(cè)定，記錄色譜圖，以龍膽苦苷色譜峰為參照峰，計(jì)算得各共有峰的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于等于3.0%、相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于等于5.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 供試品測(cè)定

取2.1項(xiàng)下制備的藥材、飲片各15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑(S1～S15)，按2.2.1項(xiàng)下制備方法制備樣品，按2.2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

2.3 指紋圖譜質(zhì)量傳遞性分析

2.3.1 指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)及色譜峰歸屬

將15批秦艽藥材、飲片的色譜圖數(shù)據(jù)文件分別導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012版)軟件，設(shè)參照?qǐng)D譜、峰匹配，采用平均數(shù)法生成指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜，見(jiàn)圖1～3。圖譜中共有5個(gè)共有峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，表2可見(jiàn)，藥材、飲片的相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均大于20%，說(shuō)明不同產(chǎn)地、不同批次藥材質(zhì)量參差不齊，含量相差較大。采用全譜峰自動(dòng)匹配計(jì)算相似度，由表3可見(jiàn)，15批秦艽藥材、飲片與各自生成的對(duì)照指紋圖譜相似度分別為0.996～0.999，0.990～0.998，說(shuō)明各產(chǎn)地不同批次藥材物質(zhì)群接近。秦艽藥材、飲片的對(duì)照指紋圖譜相似度為0.999，對(duì)藥材、飲片中的物質(zhì)群進(jìn)行歸屬分析，15批藥材、飲片中都含有5個(gè)共有峰，根據(jù)對(duì)照品可指認(rèn)峰1～5為馬錢(qián)苷酸、獐牙菜苦苷、6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷，說(shuō)明炮制對(duì)藥材的物質(zhì)群不會(huì)造成太大改變。

1 馬錢(qián)苷酸； 2 獐牙菜苦苷；3 6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷；4 龍膽苦苷；5 獐牙菜苷?qǐng)D1 對(duì)照品HPLC圖Fig.1 High-performance liquid chromatography (HPLC) chart of reference substance

圖2 15批秦艽藥材、飲片的HPLC指紋圖譜比較Fig.2 High-performance liquid chromatography (HPLC) fingerprint spectra among 15 batches of Radix Gentianae Macrophyllae medicinal herbs and standard decoction of medicinal slices

圖3 秦艽藥材、飲片對(duì)照指紋圖譜Fig.3 Referance fingerprint spectrum of Radix Gentianae Macrophyllae medicinal herbs and standard decoction of medicinal slices

峰號(hào)秦艽藥材相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差相對(duì)峰面積秦艽飲片相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差相對(duì)峰面積10.6110.0890.6110.08820.8210.0590.8200.05930.8520.1010.8520.09941.0001.0001.0001.00051.0780.0211.0780.021

表3 15批秦艽藥材、飲片指紋圖譜與各自對(duì)照指紋圖譜的相似度

2.4 出膏率及轉(zhuǎn)移率

按2.1項(xiàng)下方法制備藥材、飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑，測(cè)定各15批樣品的出膏率，公式為：出膏率=m/M×100%，其中，m為烘干后樣品質(zhì)量，M為藥材、飲片的取樣量，結(jié)果見(jiàn)表4。15批藥材、飲片出膏率平均值為20.43%、19.71%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.0%、9.6%，出膏轉(zhuǎn)移率平均值為96%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.7%，均未出現(xiàn)離散數(shù)據(jù)(均不超過(guò)平均值±30%)。

2.5 馬錢(qián)苷酸、龍膽苦苷轉(zhuǎn)移率

按2015年版中國(guó)藥典一部秦艽含量測(cè)定項(xiàng)[2]對(duì)15批藥材及飲片進(jìn)行測(cè)定，按轉(zhuǎn)移率=w/W×100%進(jìn)行計(jì)算，其中，w為飲片中馬錢(qián)苷酸、龍膽苦苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，W為藥材中馬錢(qián)苷酸、龍膽苦苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見(jiàn)表5。馬錢(qián)苷酸、龍膽苦苷從藥材到飲片的轉(zhuǎn)移率平均值分別為80.98%、80.56%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.2%、10%，均未出現(xiàn)離散數(shù)據(jù)(均不超過(guò)平均值±30%)。

表4 秦艽藥材、飲片出膏率及其轉(zhuǎn)移率

表5 秦艽藥材、飲片有效成分轉(zhuǎn)移率

3 討論

本文參照國(guó)家藥典委員會(huì)公布的《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求(征求意見(jiàn)稿)》[10]和衛(wèi)生部、國(guó)家中醫(yī)藥管理局共同下發(fā)的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》[9]，選取 15 批質(zhì)量合格的秦艽，將藥材與飲片炮制方法相結(jié)合，將干切至飲片狀的藥材與飲片，以水為溶劑，進(jìn)行規(guī)范化煎煮，制備的秦艽標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量傳遞性更好，更加標(biāo)準(zhǔn)化。

本文針對(duì)指紋圖譜方法進(jìn)行了優(yōu)化，通過(guò)全波長(zhǎng)掃描確定254 nm下色譜圖基線平穩(wěn)、分離度良好、峰信息更多，并考察不同流動(dòng)相0.1%磷酸、0.1%甲酸、0.1%醋酸，確定0.1%醋酸峰形更好；柱溫會(huì)影響保留時(shí)間及分離度，所以考察了25、30、35 ℃的柱溫，確認(rèn)柱溫為30 ℃時(shí)分離度更好，且保留時(shí)間適宜。由15批藥材、飲片的指紋圖譜的各共有峰的相對(duì)峰面積可以看出，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均大于20%，說(shuō)明不同批次的成分含量一致性較差，這與不同產(chǎn)地、氣候、土壤、采收時(shí)間、加工方式等都有關(guān)，所以購(gòu)買(mǎi)藥材盡量挑選道地產(chǎn)地、主產(chǎn)區(qū)或GAP基地，這也側(cè)面反映出中藥材的規(guī)范化種植任重道遠(yuǎn)。

利用HPLC指紋圖譜、出膏率、含量測(cè)定，對(duì)藥材、飲片進(jìn)行質(zhì)量傳遞性分析，是經(jīng)典名方及中藥配方顆粒所提倡的方法，這種整體控制的方法具有良好的科學(xué)性和合理性[12]。該方法的建立將為經(jīng)典名方研究提供借鑒，后期將應(yīng)用到藥材-飲片-中間體-對(duì)應(yīng)實(shí)物的相關(guān)性分析中。