不同產地紫花地丁中秦皮乙素的含量測定及特征圖譜研究

王笑，李圓圓，孫志強，吳明澤，高鵬，代龍

(1.山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355；2.山東禹澤藥康產業技術研究院有限公司，山東 德州 251200)

紫花地丁為堇菜科植物紫花地丁ViolayedoensisMakino的干燥全草，主要用于抗菌消炎、清熱解毒、涼血消腫[1-2]。現代藥理實驗研究表明，紫花地丁臨床上可用于治療血栓、呼吸系統疾病及艾滋病等，其主要化學成分為秦皮乙素，是香豆素類化合物，具有抗炎、抗菌、鎮痛、抗氧化等作用[3]。紫花地丁藥效多，臨床應用廣泛，而且分布廣、資源豐富,是很有開發前景的一味中藥。但目前市場上出現較多易混品，如犁頭草、紫花堇菜等，與紫花地丁為同科同屬植物，外觀性狀上難以區別[4-5]。紫花地丁藥材及其混淆品的HPLC 指紋圖譜[6]，以及高效液相色譜法測定紫花地丁中某一成分的研究已有報道。目前的指紋圖譜分析未對主要成分峰進行歸屬，無法全面反應藥材的內在質量，而且《中國藥典》[7]中沒有建立藥材的含量控制指標。因此，本文對不同產地紫花地丁中秦皮乙素的含量進行研究，建立了紫花地丁藥材特征圖譜，為紫花地丁藥材標準化種植及藥材質量標準全面提升提供數據支撐。

1 儀器與材料

1.1 藥材

紫花地丁ViolayedoensisMakino均采自不同產地，經濟南市藥檢所宋希貴主任藥師鑒定為紫花地丁，均為人工種植藥材。藥材主要來源于山東、河南、山西、安徽4個省份，見表1。

表1 紫花地丁藥材來源信息

1.2 儀器與試劑

LC-2030高效液相色譜儀(日本島津制作所)；Mettler Toledo XS105電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；KDM型可調控溫電熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司)；高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)。

色譜甲醇、色譜乙腈(Sigma-Alorich)；秦皮乙素(110741-201708)對照品(中國食品藥品檢定研究院)；東莨菪內酯(110768-200504)對照品(中國食品藥品檢定研究院)；木犀草素(111520-201605)對照品(中國食品藥品檢定研究院)，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 紫花地丁中秦皮乙素含量測定

2.1.1 紫花地丁供試品溶液的制備

取紫花地丁粗粉0.4 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加體積分數60%的甲醇50 mL，稱定質量，加熱回流處理30 min，放冷，再稱定質量，以60%的甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取濾液，即得。

2.1.2 色譜條件

色譜柱：Kinetex OOD-C18(100 mm×4.6 mm，2.6 μm)；流動相：乙腈-0.4%磷酸溶液，梯度洗脫程序見表2。流速1 mL·min-1；檢測波長350 nm；柱溫30 ℃；進樣量5 μL。

表2 HPLC梯度洗脫程序表

2.1.3 對照品溶液的制備

精密稱取秦皮乙素對照品17.07 mg、東莨菪內酯對照品11.27 mg、木犀草素對照品12.03 mg，分別置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，置于4 ℃冰箱保存。

2.1.4 方法學考察

(1)線性關系考察

取秦皮乙素對照品適量，精密稱定17.07 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為貯備液(0.682 8 g·L-1)。精密量取貯備液1、2、3、4、5、6 mL，分別置于50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。分別進樣5 μL，測得峰面積，計算回歸方程[8]。

(2)精密度實驗

取秦皮乙素對照品溶液68.28 μg·mL-1，進樣5 μL，連續進樣6次，測得峰面積值。

(3)穩定性實驗

取樣品約0.4 g，精密稱定，按2.1.1的制備方法，制備供試品溶液，分別測定在不同時間的峰面積。

(4)重復性實驗

取樣品0.4 g，取6份，精密稱定，按2.1.1的制備方法，制備供試品溶液，測定。

(5)加樣回收實驗

取紫花地丁藥材(已知秦皮乙素含量為7.22 mg·g-1)6份，每份約0.2 g，精密稱定，分別精密加入秦皮乙素對照品的甲醇溶液各50 mL，按2.1.1的制備方法，制備供試品溶液，測定。

2.1.5 樣品測定

取15個批次的紫花地丁藥材粗粉各0.4 g，精密稱定，按2.1.1項下方法制備樣品溶液，測定秦皮乙素的含量，每個批次平行測定2份，計算其含量及相對標準偏差。

2.1.6 數據處理

實驗數據采用x±δSD表示，用Graphpad軟件進行分析，P<0.05表示有顯著性差異，P<0.01表示有極顯著性差異。

2.2 紫花地丁藥材特征圖譜

2.2.1 方法學考察

(1)精密度實驗：取同一批次紫花地丁供試品溶液，按給定色譜條件進行測定，連續進樣6次，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統對精密度實驗的圖譜進行分析，計算共有峰的相對保留時間與相對峰面積的相對標準偏差，考察儀器的精密度。

(2)重復性實驗：按2.1.1項下方法分別制備6份供試品溶液，按給定色譜條件進行測定，同上法進行分析，考察實驗方法重復性。

(3)穩定性實驗：取同一批次供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12 h進行檢測，同上法進行分析，考察樣品的穩定性[9-10]。

2.2.2 建立紫花地丁藥材特征圖譜

依次測定15批紫花地丁藥材供試品溶液，采用高效液相色譜儀記錄20 min的色譜圖，即得。根據15批次紫花地丁藥材供試品測定結果所顯示的峰個數、相對保留時間和相對峰面積等相關參數，進行分析比較，制定優化的特征圖譜。

3 結果

3.1 含量測定結果

3.1.1 方法學考察結果

(1)線性關系 秦皮乙素的線性方程與回歸系數分別為：Y=2 265 495.02X-87 370，r=0.999 8，結果表明秦皮乙素進樣量在0.068 28～0.409 68 μg范圍內線性關系良好。

(2)精密度 秦皮乙素的峰面積相對標準偏差為0.3%，表明儀器精密度良好。

(3)穩定性 不同時間點秦皮乙素含量的相對標準偏差為0.91%，表明本品溶液在12 h內穩定。

(4)重復性 不同樣品中秦皮乙素含量的相對標準偏差為0.97%，表明本測定方法重復性良好。

(5)加樣回收率 平均回收率為 99.18%，相對標準偏差為1.48%，表明本方法合理可靠。

3.1.2 樣品中秦皮乙素含量測定

15批紫花地丁藥材因產地不同，秦皮乙素含量有所不同，河南產地秦皮乙素含量普遍偏高，山東臨沂市普遍偏低，安徽亳州市含量差異明顯。各產地紫花地丁秦皮乙素含量見表3，不同產地間秦皮乙素含量的顯著性差異見圖1。

表3 不同產地紫花地丁藥材中秦皮乙素含量

圖1 不同產地間秦皮乙素含量的顯著性差異Fig.1 Significant difference of aesculin content among different habitats

P<0.05表示有顯著性差異；P<0.01表示有極顯著性差異；山西與安徽沒有顯著性差異。

3.2 特征圖譜方法學考察

3.2.1 精密度

運用“中藥指紋圖譜相似度評價系統”計算[5]，結果相似度均大于0.99，各共有峰的相對保留時間、相對峰面積的相對標準偏差均小于3%，表明儀器精密度良好(圖2)。

圖2 精密度實驗圖譜匹配結果Fig.2 Chromatogram matching results of precision test

3.2.2 重復性

結果相似度均大于0.97，所得的6個色譜圖中各共有峰相對保留時間、相對峰面積的相對標準偏差均小于3%，表明該方法的重復性良好(圖3)。

圖3 重復性實驗圖譜匹配結果Fig.3 Chromatogram matching results of repeatability test

3.2.3 穩定性

結果相似度均大于0.96，所得的6個色譜圖中各共有峰相對保留時間，相對峰面積的相對標準偏差均小于3%，表明供試品溶液在12 h的實驗過程內保持穩定(圖4)。

圖4 穩定性實驗圖譜匹配結果Fig.4 Chromatogram matching results of stability test

3.2.4 測定15批次紫花地丁特征圖譜及其相似度評價

實驗測得15批次紫花地丁藥材特征圖譜，可分離出近6個色譜峰。與共有模式對照圖譜比較，可以得到6個共有峰，作為特征圖譜特征峰(圖5、圖6)，并指認3個色譜峰(圖7)。以4號峰為S峰，1～6號共有色譜峰的相對保留時間分別為：0.42、0.56、0.74、1、1.15、1.33，相對峰面積分別為0.06、0.12、0.17、1、0.04、0.07。圖6為15批次不同產地紫花地丁藥材供試品的特征圖譜，與生成的對照圖譜比較，15批次相似度均大于0.9，表明不同批次間藥材比較穩定；相似度見表4。

圖5 紫花地丁藥材對照特征圖譜Fig.5 Controlled characteristic chromatogram of Violae Herba

圖6 15批次不同產地紫花地丁藥材特征圖譜Fig.6 Characteristic chromatogram of 15 batches of Violae Herba from different habitats

a紫花地丁藥材供試品; b東莨菪內酯對照品; c秦皮乙素對照品; d木犀草素對照品圖7 對照品特征圖譜Fig.7 Characteristic chromatogram of reference substances

樣品相似度樣品相似度10.98790.99920.986100.98630.987110.99940.997120.99950.999130.99860.999140.99770.999150.99880.999

4 討論

紫花地丁中的秦皮乙素具有多種藥理作用，因此本研究主要針對秦皮乙素成分的測定建立特征圖譜。通過考察15批次不同產地紫花地丁HPLC特征圖譜并運用“中藥指紋圖譜相似度評價系統”進行數據處理[12]，找出6個共有峰，計算了各批次紫花地丁藥材特征圖譜的相似度。本研究所建立的方法具有重復性好、特征性強、方法簡便等特點, 能較好地區分藥材質量，可以作為紫花地丁的品質鑒別、質量控制及資源綜合利用的依據。