淋巴毒素β受體、TIPE2和可溶性PD-1分子在類風濕性關節(jié)炎患者中的表達及其臨床意義①

馮秀南 姜振宇

(吉林大學第一醫(yī)院風濕免疫科，長春 130021)

類風濕性關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是常見的一種慢性自身免疫性疾病，臨床調查顯示我國患者患病率為0.4%左右，以關節(jié)外病變、多滑膜關節(jié)炎等為主要臨床表現(xiàn)，嚴重影響人們身心健康和生活質量[1,2]。目前，對于RA具體發(fā)病機制尚未完全闡明，臨床上僅對癥治療，大部分無法徹底治愈疾病[3]。因此，分析RA的發(fā)病機制，尋找新的有效的治療靶點，仍為臨床工作者迫切需要解決的問題。淋巴毒素β受體(LTβR)是腫瘤壞死因子受體超家族成員之一，研究發(fā)現(xiàn)其與自身免疫密切相關[4]。TIPE2屬腫瘤壞死因子α誘導的蛋白8家族的一員，是新發(fā)現(xiàn)的一種免疫負調控因子，其在多種人類自身免疫性疾病中異常表達[5]。近年來，可溶性PD-1分子(sPD-1)成為免疫學研究的熱點，有望成為自身免疫性疾病治療的有效靶分子[6]。因此，本文研究旨在探討LTβR、TIPE2和sPD-1在RA患者中的表達及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1材料

1.1.1臨床資料 選擇吉林大學第一醫(yī)院于2017年5月至2018年5月期間收治的RA患者93例作為研究組，依據(jù)《類風濕關節(jié)炎診斷及治療指南》[7]中關于RA診斷標準：①關節(jié)內或關節(jié)周圍晨僵，且每日持續(xù)1 h以上，持續(xù)6周以上；②類風濕性因子陽性；③ 3個或者3個以上關節(jié)，且同時出現(xiàn)腫脹或積液；④影像學檢查：手及腕部前后位攝片顯示有骨質疏松或骨質侵蝕。納入的93例患者中，男57例，女36例；年齡41～75歲，平均年齡(59.98±4.61)歲；其中急性活動期54例，緩解期39例。另選擇同期收治的骨關節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)患者61例作為對照組，其中男35例，女26例；年齡40～75歲，平均年齡(60.13±5.34)歲。兩組性別、年齡一般資料具有可比性(P>0.05)，差異無統(tǒng)計學意義。所有研究對象均經(jīng)吉林大學第一醫(yī)院倫理委員會批準，且獲得知情同意。

1.1.2主要試劑與儀器 熒光定量PCR儀、RNA分離試劑盒、TaqMan PCR主要混合物、SYBR Green實時熒光定量 PCR 預混液、DEPC水、實時熒光定量PCR檢測試劑盒均購自美國Bio-Rad公司，PCR引物由上海生工生物工程(股份)有限公司合成。

1.2方法

1.2.1標本采集 所有研究對象采集關節(jié)腔積液，行關節(jié)腔穿刺，抽取患者關節(jié)腔積液2 ml，2 500 r/min，離心10 min，分離關節(jié)腔積液，放置于-20℃下保存待測。

1.2.2熒光定量PCR檢測LTβR、TIPE2和sPD-1表達 采集患者關節(jié)腔積液提取總RNA，提取方法為經(jīng)典的異硫氰酸胍法，嚴格依據(jù)總RNA抽提試劑盒說明書標準進行總RNA的提取，徹底干燥，溶解于DEPC 處理水20 μl中，取11 μl總RNA用于cDNA的合成，嚴格參照cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進行具體操作，總反應體系為20 μl，將得到的cDNA放置于-70℃下保存待測。取2 μl用于實時熒光定量PCR擴增。對LTβR、TIPE2和sPD-1 mRNA進行PCR反應條件的優(yōu)化，檢測樣本LTβR、TIPE2和sPD-1 mRNA相對表達量，以GAPDH mRNA作為內參，以2-ΔΔCt的相對定量法計算LTβR、TIPE2和sPD-1 mRNA相對表達量。引物序列采用Primer Premier 6.0軟件自行設計，均符合熒光定量PCR引物的要求。見表1。

2 結果

2.1兩組患者關節(jié)腔積液中LTβR、TIPE2和sPD-1 mRNA相對表達量比較 見表2。研究組關節(jié)腔積液中LTβR和sPD-1 mRNA相對表達量高于對照組，而TIPE2 mRNA相對表達量低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2RA不同特征關節(jié)腔積液中LTβR mRNA相對表達量比較 見表3。不同性別和年齡關節(jié)腔積液中LTβR mRNA相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；急性活動期關節(jié)腔積液中LTβR mRNA相對表達量高于緩解期，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 引物序列

Tab.1 Primers of RT-PCR

GeneSequence of primersLTβRForward:5′-GCACAAGCAAACGGAAGACC-3′Reverse: 5′-GACCTTGGTTCTCACACCTGGT-3′TIPE2Forward:5′-GTCGGTTCGGTAGCGCTGCT-3′Reverse:5′-TATCCTGGAACGTACGTATG-3′sPD-1Forward:5′-GGGTGACAGAGAGAAGGGCAGA-3′Reverse:5′-TGGCTCCTATTGTCCCTCGTGC-3′GAPDHForward:5′-GTCAACGGATTTGGTCGTATTC-3′Reverse:5′-CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3′

Clinical characteristicsnRelative expressiontPGender Male570.81±0.290.742>0.05 Female360.85±0.18Age >60 years old450.86±0.271.401>0.05 ≤60 years old480.79±0.21Phase Active phase540.98±0.296.281<0.05 Release phase390.65±0.18

Clinical characteristicsnRelative expressiontPGender Male570.21±0.081.342>0.05 Female360.19±0.05Age >60 years old450.19±0.121.427>0.05 ≤60 years old480.22±0.08Phase Active phase540.13±0.0315.018<0.05 Release phase390.29±0.07

2.3RA不同特征關節(jié)腔積液中TIPE2 mRNA相對表達量比較 見表4。不同性別和年齡關節(jié)腔積液中TIPE2 mRNA相對表達量比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；急性活動期關節(jié)腔積液中TIPE2 mRNA相對表達量低于緩解期，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4RA不同特征關節(jié)腔積液中sPD-1 mRNA相對表達量比較 見表5。不同性別和年齡關節(jié)腔積液中sPD-1 mRNA相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；急性活動期關節(jié)腔積液中sPD-1 mRNA相對表達量高于緩解期，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

目前，RA的具體發(fā)病原因尚未完全闡明，普遍認為是由過度活化的T淋巴細胞介導的一種自身免疫性疾病[8，9]。且相關研究報道表明，RA患者體內多種協(xié)同刺激分子失衡，則會促進疾病的發(fā)生[10]。淋巴毒素(LT)是最早發(fā)現(xiàn)的一種細胞因子，主要是淋巴細胞受有絲分裂原或者抗原等刺激活化后及在某些自身免疫疾病和腫瘤情況下分泌的細胞因子[11]。LT與腫瘤壞死因子-α是密切相關的兩個細胞因子，同時轉移因子家族。LT與腫瘤壞死因子-α有許多相似的生物學功能，如誘導多種分化細胞的抗原表達、炎癥反應的應答、免疫反應的調節(jié)以及多種腫瘤細胞的殺傷作用[12]。LTβR是轉移因子受體超家族成員之一，是調節(jié)器官和組織內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一種重要中間介質。LTβR能夠激活NF-κB途徑，促進炎癥的反應。LTβR在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮信號傳遞功能，若其調節(jié)異常則會導致自身炎癥和免疫性疾病，包括自身免疫性胰腺炎、類風濕性關節(jié)炎等[13]。本文研究結果顯示，研究組關節(jié)腔積液中LTβR mRNA相對表達量高于對照組，急性活動期關節(jié)腔積液中LTβR mRNA相對表達量高于緩解期，提示RA患者sPD-1 mRNA表達明顯上升，且急性活動期其表達上升越高。sPD-1是1992年發(fā)現(xiàn)CD28超家族中一員，主要由2號染色體上PDCD1基因變化，其在T細胞雜交瘤細胞死亡過程中表達上調[14]。 sPD-1在感染、腫瘤、自身免疫病等疾病中發(fā)揮重要作用。有研究顯示，RA患者滑膜液中PD-1+T細胞和PD-L1+T單核細胞數(shù)量增加，并且其在RA的滑膜炎病程中發(fā)揮重要作用[15]。此外，有研究顯示，RA患者急性活動期sPD-1顯著高于緩解期，可能sPD-1對RA活動期發(fā)揮了更重要的作用[16]。本研究結果顯示，研究組關節(jié)腔積液中sPD-1 mRNA相對表達量高于對照組，急性活動期關節(jié)腔積液中sPD-1 mRNA相對表達量高于緩解期，提示RA患者sPD-1 mRNA表達明顯上升，且急性活動期其表達上升更高，與上述文獻報道基本一致。TIPE2在維持機體免疫穩(wěn)態(tài)中具有重要調節(jié)作用，主要表達于淋巴結、脾臟、胸腺等免疫應答組織中[17]。實驗研究報道表明，TIPE2基因敲除小鼠會發(fā)生IL-1、IL-12和腫瘤壞死因子-α等炎癥因子表達升高及發(fā)生多器官自發(fā)性炎癥[18]。本研究結果顯示，研究組關節(jié)腔積液中TIPE2 mRNA相對表達量低于對照組，急性活動期關節(jié)腔積液中TIPE2 mRNA相對表達量低于緩解期，提示RA患者sPD-1 mRNA表達降低，且急性活動期表達下降更加明顯。

Clinical characteristicsnRelative expressiontPGender Male570.19±0.091.177>0.05 Female360.17±0.06Age >60 years old450.20±0.081.928>0.05 ≤60 years old480.17±0.07Phase Active phase540.24±0.099.727<0.05 Release phase390.09±0.04

綜上所述，LTβR和sPD-1高表達及TIPE2低表達參與RA病情發(fā)生、發(fā)展，在RA診斷中具有一定的價值，值得臨床借鑒。