氨磷汀提高人食管癌細胞對順鉑的敏感性

劉華松 徐蘭蘭

(1十堰市太和醫院湖北醫藥學院附屬太和醫院胸心大血管外科，湖北 十堰 442000；2湖北醫藥學院)

食管癌是常見的惡性實體腫瘤，由于容易對化療藥物產生耐藥而導致治療效果差〔1〕。順鉑是治療食管癌的一線化療藥，其主要作用是導致細胞DNA損傷和氧化應激，然而隨著化療周期的增加腫瘤細胞通過增強DNA修復能力和對順鉑的生物轉化增強而對順鉑產生耐藥〔2〕。因此，尋找提高腫瘤細胞化療藥物敏感性的臨床化療佐劑成為研究熱點。氨磷汀是一種廣譜細胞保護劑，既能降低甚至消除化療藥物的毒副作用，又不降低藥物療效，在臨床上已經作為一些腫瘤化療的佐劑，提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性〔3，4〕。目前尚未見到氨磷汀對順鉑耐藥的人食管癌細胞化療敏感性影響的相關報道。本文體外研究氨磷汀對人食管癌細胞株ECA109順鉑敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人食管癌細胞株ECA109本室保存。氨磷汀、順鉑(美國Sigma公司)；RPMI1640(美國Gibco公司)，B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、多藥耐藥關聯蛋白(MRP)1抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.2實驗分組 ①對照組：未進行藥物處理；②順鉑組：在培養液中加入2.0 mg/L順鉑；③氨磷汀組：在培養液中分別加入0、5、10、20 μg/ml的氨磷??；④聯合組：在培養液中加入2.0 mg/L順鉑和10 μg/ml的氨磷汀。其中氨磷汀組，分別于培養24、48和72 h收集細胞進行檢測；其他各組于培養48 h后收集細胞進行檢測。

1.3四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測各組細胞增殖活性 取生長狀態良好的細胞以7×103/200 μl的密度接種于96孔培養板各孔內，空白對照孔僅加入200 μl完全培養液。按照上述分組情況在不同時間點收集細胞進行檢測，各體系均設6個平行孔。測量前，每孔加入濃度為5 mg/ml的MTT溶液各20 μl，繼續培養4 h后去掉培養液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)輕搖混勻10 min至結晶溶解，用酶標儀在490 nm波長處測定吸光度(OD)值，計算細胞存活率和半數抑制濃度(IC50)，實驗重復3次。

1.4流式細胞術檢測各組細胞凋亡率和細胞周期 收集四組ECA109細胞，其中氨磷汀組只選取10 μg/ml濃度組，各組均在培養48 h后制成細胞懸液，以105/ml的濃度接種于6孔板中，每組均設3個復孔，各組反應體系為2 ml，培養24 h后收集細胞離心后與Annexin V及碘化丙啶(PI)作用15 min，流式細胞儀上檢測細胞周期和凋亡率，計算增殖指數。

1.5Western印跡檢測耐藥蛋白與凋亡蛋白的表達 取對照組、順鉑組、氨磷汀(10 μg/ml)組和聯合組細胞，培養48 h后提取全細胞蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離和轉膜，封閉后加入一抗Bcl-2、Bax、MRP1和β-actin，4 ℃過夜，次日滴加二抗(1∶1 000)37 ℃避光孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min，用Odyssey掃描系統進行檢測及灰度分析，以β-actin為內參，用目標蛋白條帶與β-actin條帶的灰度比值表示蛋白的相對表達量。

1.6統計學分析 應用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.1氨磷汀對ECA109細胞增殖抑制率的影響 與對照組比較，隨著氨磷汀作用濃度的升高和作用時間的延長，細胞增殖活性未見明顯改變(P>0.05)，見表1。

表1 氨磷汀對培養不同時間點ECA109細胞增殖抑制率的影響

2.2氨磷汀與順鉑聯合應用對ECA109細胞增殖活性的影響 與對照組(A值：1.001±0.001)和氨磷汀組(A值：0.997±0.002)、順鉑組(A值：0.519±0.052)比較，聯合組可顯著降低細胞增殖活性(A值：0.283±0.036，均P<0.01)。

2.3氨磷汀與順鉑聯合應用對ECA109細胞凋亡和細胞周期的影響 與對照組比較，聯合組細胞G0/G1期和凋亡率明顯升高(P<0.01)，增殖指數、S期和G2/M期明顯降低(P<0.01)；與順鉑組比較，聯合組細胞凋亡率明顯升高(P<0.01)，增殖指數、S期和G2/M期明顯降低(P<0.01)；對照組、順鉑組和氨磷汀組G0/G1期、S期和G2/M期、增殖指數和凋亡率無顯著差異(P>0.05)，見表2。

表2 氨磷汀與順鉑聯合應用對ECA109細胞凋亡率和細胞周期的影響

與對照組比較：1)P<0.01；與順鉑組比較：2)P<0.01；與氨磷汀組比較：3)P<0.01，下表同

2.4氨磷汀與順鉑聯合應用對ECA109細胞耐藥相關蛋白與凋亡相關蛋白表達的影響 與對照組和順鉑組比較，聯合組細胞內Bcl-2和MRP1蛋白的表達明顯降低(P<0.05)；氨磷汀組細胞內MRP1明顯降低(P<0.05)，見圖2，表3。

圖2 氨磷汀聯合順鉑對ECA109細胞Bcl-2、Bax和MRP1蛋白表達的影響

組別Bcl-2BaxMRP1對照組0.623±0.0190.430±0.0130.386±0.011順鉑組0.304±0.0120.452±0.0180.127±0.008氨磷汀組0.589±0.0170.461±0.0200.408±0.014聯合組0.117±0.0091)2)3)0.455±0.0160.051±0.0021)2)3)

3 討 論

氨磷汀是第一個被國際上廣泛認可的細胞保護劑，在臨床上用于減輕放療引起的副作用〔5〕。研究還發現氨磷汀與化療藥物聯合應用，可以減輕化療藥物的全身毒性作用，提高化療劑量與強度，從而提高化療藥物的臨床療效〔6～8〕。

化療是惡性腫瘤綜合治療中的主要方法之一，療效降低的主要問題是對正常細胞的損傷和耐藥的發生〔9〕。逐漸興起的細胞保護劑主要用來預防和減輕放化療引起的正常組織細胞的毒性作用，提高患者的耐受性與順應性，從而提高化療效果和患者生活質量〔10〕。有研究表明氨磷汀主要分布在正常組織細胞內，極少分布于腫瘤組織內，在不影響化療藥物抗腫瘤活性的同時選擇性地保護正常組織，甚至在一些臨床研究中發現氨磷汀發揮化療增敏作用〔11～13〕。本研究結果說明氨磷汀可能對細胞的增殖有一定抑制作用，至少氨磷汀不會對ECA109細胞產生細胞保護作用，此結果與王根菊等〔14〕的結果研究一致。

食管癌是發生于食管黏膜上皮組織的惡性度較高的腫瘤，臨床上仍以手術前化療結合術后輔助化療為主要手段改善食管癌患者的長期生存率〔15〕。目前，順鉑是治療進展期食管鱗癌的常用藥物，但高劑量重復用藥往往引起全身多器官系統的損傷和耐藥，很大程度上限制了順鉑的應用〔16〕。因此，提高食管癌細胞對順鉑的敏感性并降低順鉑的毒副作用成為臨床化學藥物治療食管癌的主要策略。本研究結果表明氨磷汀可能并不直接導致ECA109細胞增殖抑制或凋亡。同時，氨磷汀與順鉑聯合應用組細胞的凋亡率卻較順鉑組明顯增加，說明氨磷汀可以提高ECA109細胞對順鉑的敏感性。Bcl-2是抗凋亡蛋白，Bax是促凋亡蛋白，二者發揮協同作用，共同調節細胞凋亡，通常用Bcl-2/Bax 在細胞內表達的比值來判斷凋亡過程是否是Bcl-2蛋白介導的〔17〕。本研究結果表明氨磷汀與順鉑聯合應用可以誘導更顯著的細胞凋亡。

腫瘤細胞的重要特征是持續分裂增殖，細胞的增殖通過細胞周期實現〔18〕。細胞周期包括S期與M期兩個功能階段和G1期與G2期兩個準備階段，各期的細胞內DNA含量不同，以此檢測細胞的增殖活性〔19〕。本研究結果表明氨磷汀與順鉑聯合應用阻止細胞DNA復制，抑制細胞增殖，與細胞凋亡結果一致。MRP1是食管癌發生耐藥的相關耐藥蛋白，本研究結果顯示，氨磷汀與順鉑聯合應用可以明顯降低ECA109細胞MRP1的表達，同時，氨磷汀單純用藥組也能降低MRP1蛋白的表達，表明氨磷汀可以提高食管癌細胞的化療敏感性。

綜上所述，本研究證實，氨磷汀雖然不具有明顯的抑制食管癌細胞增殖的作用，但可提高食管癌細胞對順鉑的化療敏感性。