高鋁暴露通過PI3K信號通路致大鼠糖耐量異常的作用及機制

楊大偉 韋喜 黃慶 何明杰 王民登 吳標良

(右江民族醫學院附屬醫院內分泌科，廣西 百色 533000)

環境因素與糖尿病的發病密切相關〔1〕。Levine等〔2〕報道,鋁元素在人體組織中蓄積到一定程度后,會增加糖尿病發生的危險度,但未能進一步闡明其機制。Obukhova等〔3〕對396例鋁廠工人定期體檢結果進行分析,發現鋁產業工人2型糖尿病的發病率較正常人群升高,并建議有必要對鋁產業工人實施保護措施。鋁暴露與糖耐量異常密切相關，但機制仍不清楚。本研究擬觀察高鋁暴露對大鼠糖耐量及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信號通路相關蛋白表達水平變化，探討高鋁暴露對糖耐量異常的影響及機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及試劑 Wistar大鼠(雌雄各半)購于右江民族醫學院實驗中心動物房(CL級，動物許可證號：syxk桂2011-0010),體重250～300 g。氯化鋁粉購自西安化工石。抗胰島素受體底物(IRS)1抗體(ab52167)、抗胰島素受體(IR)-β抗體〔C18C4〕(ab69508)購于ABCAM(英國)，Phospho-IRS-1(Ser307)抗體#2381購于CST1，人短效胰島素(優泌林R)購于禮來公司(美國)。本研究符合本院實驗動物倫理委員會標準。

1.2動物分組及造模 將大鼠隨機分為高鉛暴露組和對照組，每組30只，根據參考文獻〔4〕，制作高鋁暴露條件。高鋁暴露組使用三氯化鋁40 mg/kg,1次/d，尾靜脈注射；對照組從尾靜脈注射生理鹽水3 ml/kg,1 次/d,同步實驗,連續注射7 d。造模過程中，對照組死亡1只(可能與注射生理鹽水速度過快有關)，高鋁暴露組死亡2只(可能與注射三氯化鋁有關)，已根據實驗前設定補充入組，最終實驗例數仍為每組30只。

1.3口服葡萄糖耐量試驗(OGTT) 隨機每組抽取8只大鼠，取20%的葡萄糖溶液比例按10 ml/kg將禁食12 h的大鼠經灌胃給藥。于實驗開始后0、30、60、120 min尾靜脈取血1次，約10 μl，使用羅氏血糖儀進行血糖測定，并計算血糖曲線下面積(AUC)。葡萄糖AUC=1/4(0 min血糖 +30 min血糖)+1/4(30 min血糖 +60 min血糖)+1/2(60 min血糖+120 min血糖)。

1.4高胰島素正葡萄糖鉗夾(HECT)試驗 隨機抽取兩組各8只大鼠，實驗參考Kraegen等〔5〕的方法。實驗前禁食12 h。將大鼠單獨置于可自由活動小鐵籠內，頸動、靜脈導管分別與采血延長管和輸液管連接，整個實驗過程中保持安靜，盡量減少環境干擾。待大鼠適應新環境后開始從頸動脈導管采血測基礎血糖值和胰島素值。經頸靜脈注射重組人胰島素(優泌林R)10 mU/(kg·min)，每5 min取頸動脈血測定全血血糖，如血糖低于5.0 mmol/L后開始同時經頸靜脈輸入20%葡萄糖溶液，繼續每5 min使用羅氏血糖儀測定血糖，并據血糖值調整葡萄糖輸注率(GIR)，將血糖維持在4.8～5.2 mmol/L,連續3次均在上述范圍時，提示鉗夾成功，進入穩態。以穩定時5次GIR的平均值評價胰島素敏感性。

1.5Western印跡法測定IR-β、IRS-1及IRS-1 Ser307磷酸化蛋白 提取小鼠肝臟組織，裂解、離心、分裝以備用，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，半干法轉膜，加入Western封閉液，室溫下封閉1 h，將抗IR、IRS-1、IRS-1 Ser307磷酸化及抗β-actin抗體按說明書稀釋至合適濃度，進行一抗孵育，4℃冰箱中搖床上過夜，加入羊抗小鼠二抗抗體，室溫下搖床上孵育1 h，化學發光,顯影、定影。用高清掃描儀掃描膠片，然后使用ImageJ軟件半定量法分析目標帶凈光密度值(以特異性條帶濃度與面積的乘積為有效值，反映蛋白表達水平)。

1.6統計學方法 采用SPSS13.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1OGTT結果 與對照組相比，高鋁暴露組30、60、120 min血糖水平明顯高于對照組(P<0.01)，AUC顯著高于對照組(P<0.05)，見表1。

2.2HECT試驗結果 與對照組〔(11.80±1.80)mg/min〕相比，高鋁暴露組外周組織GIR〔(3.80±0.70)mg/min〕明顯降低(P<0.01)。

2.3Western印跡檢測結果 與對照組相比，高鋁暴露組肝臟中IR-β、IRS-1表達顯著下降，IRS-1 ser307表達顯著升高(P<0.05)。見表2，圖1。

表1 兩組血糖水平及AUC比較

與對照組比較：1)P<0.01；下表同

表2 兩組肝臟組織中IR-β、IRS-1及IRS-1 Ser307的相對光密度值比較

圖1 兩組肝臟組織中IR-β、IRS-1及IRS-1 Ser307的表達

3 討 論

糖尿病早期表現主要為糖耐量異常，本研究表明，在高鋁暴露后，大鼠OGTT中表現出了糖耐量減低的情況。糖耐量異常的影響因素非常多，機制十分復雜，但其中最重要的是胰島素抵抗。

胰島素抵抗與PI3K信號轉導通路密切相關。PI3K信號通路中有幾個重要組成部分：IR、IRS、葡萄糖轉運體蛋白等。IR是由位于人類基因組19 P13.3～13.2區的基因所編碼。目前已發現50種以上IR的點狀突變或片段缺失,與嚴重的胰島素抵抗發生有關〔6〕。IRS主要包括IRS-1和IRS-2。IRS-1是一種受體信號傳導蛋白,主要分布在肌肉、肝臟、脂肪等胰島素敏感組織內。IRS-1的表達不足和磷酸化的異常均可導致胰島素結合后不能有效地轉運葡萄糖,從而引起胰島素抵抗〔7,8〕。另外IRS-1磷酸化在胰島素抵抗的發生過程中起十分重要的作用。目前有研究表明〔9,10〕,2型糖尿病患者脂肪細胞InR與IRS-1的結合是正常的,但IRS-1的酪氨酸磷酸化水平低于正常人,而其絲氨酸磷酸化的水平會高于正常人,起負反饋調節作用。胰島素抵抗患者骨骼肌細胞IRS-1酪氨酸磷酸化水平較正常人降低,同時IRS-1含量也下降。有研究表明,敲除IRS-1基因而保留IRS-2基因的大鼠僅出現胰島素抵抗,但其胰島β細胞胰島素的分泌會代償性增加,未出現糖尿病；而敲除IRS-2保留IRS-1的大鼠則因未出現β細胞的代償性分泌而更早地出現了糖尿病〔11，12〕。

胰島素的跨膜信號轉導需要胰島素與細胞膜表面的IR結合,IR會使自身β亞基膜內部分的酪氨酸殘基磷酸化,提高其酪氨酸蛋白激酶活性,并進一步使其膜內IRS-1的酪氨酸殘基磷酸化。IRS-1 Ser307的主要作用為對胰島素生物效應起反饋調節。當IRS-1 Ser307被磷酸化后,IRS-1酪氨酸磷酸化水平就會被抑制,胰島素信號傳導就會減弱,就會導致胰島素抵抗。本研究表明，高鋁暴露導致大鼠糖耐量異常的主要原因可能是高鋁暴露導致IR-β、IRS-1蛋白水平下降，影響胰島素信號的跨膜轉導，同時IRS-1 Ser307磷酸化的增高負反饋抑制了IRS-1的作用，從而使葡萄糖轉運障礙，出現糖耐量異常。綜上，高鋁暴露可誘導大鼠糖耐量異常發生，其機制可能與PI3K通路受抑制有關。