維甲酸誘發C57小鼠骨質疏松模型的形態學和骨密度變化

周圓媛

(川北醫學院生理學教研室，四川 南充 637000)

骨質疏松是一種以骨量減少，骨微結構破壞，骨脆性增加和易發骨折的代謝性骨病〔1〕。骨質疏松性骨折及其并發癥的致殘率和死亡率明顯增加。據流行病學調查顯示，骨質疏松的發病率在各種常見病中排第7位，我國骨質疏松的總發病率在60歲以上的人群中高達58%〔2〕。隨著我國人口老齡化進程，骨質疏松患病率越來越高，已成為了社會嚴重的公共健康問題。目前骨質疏松的病因及其發病機制尚不明確。

1 材料與方法

1.1實驗動物 3月齡SPF級野生型C57小鼠100只，雌雄各半，體重23～27 g。飼養條件：溫度18～20℃，通風較好，空氣濕度55%～65%，專用無菌蒸餾水、無菌飼料喂養。灌胃前適應性飼養2 w，觀察小鼠的一般狀況，根據小鼠體重和一般狀況調整灌胃藥物劑量(不小于最低劑量)。動物實驗人員具備動物實驗從業資格，實驗中對實驗動物的處置符合實驗動物倫理委員會要求。

1.2實驗動物分組及模型建立 100只小鼠隨機分為骨質疏松組和對照組各50只，雌雄各半。參照徐洪璋等〔3〕的實驗方法，骨質疏松組每日0.9%維甲酸(90 ml/kg)灌胃，對照組每日0.9%氯化鈉注射液(90 ml/kg)灌胃，持續21 d。

1.3骨組織標本制備 采用脊椎脫臼法將小鼠處死。測量體重后將其仰臥位固定于木板上，自兩側髖關節切開腹部皮膚，剔除肌肉、軟組織，取出小鼠雙側股骨和脛骨。電子天平稱量雙側股骨和脛骨濕重，取平均值(精確到0.01 g)。將取出的股骨、脛骨置入4%中性甲醛溶液中保存以備后續檢查。

1.4骨組織形態學檢查 Micro-CT掃描機對脛骨近端干骺端進行掃描。 在脛骨近端干骺端區域選取0.6×0.6×0.6 mm3感興趣區域(ROI)，設定掃描機電流80 μA、電壓80 kV、分辨率14 μm、掃描時間30 min，對ROI進行連續360°斷層掃描，并進行三維重建，觀察骨小梁的數目、結構、形態、粗細、走向等變化。

1.5統計學處理 采用SPSS22.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1一般狀況 對照組牙面整齊，牙釉質牙頸部未見缺損；骨質疏松組牙面可見白色粉筆樣改變，牙釉質牙頸部呈片狀剝脫樣缺損，沒有肉眼可見的骨折。對照組體重、股骨、脛骨濕重顯著高于骨質疏松組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組體重和股骨、脛骨濕重比較

與對照組比較：1)P<0.05；下表同

2.2骨組織形態學改變 脛骨近端干骺端ROI顯示：對照組骨小梁的走向大致相同，粗細較均勻，排列緊密有序，有一定厚度；骨質疏松組骨小梁厚度變薄，數量變少，小梁間走向不一致，有斷裂，分離度增大，形態不規則，網狀結構消失，排列不均勻。見圖1。

圖1 脛骨近端干骺端Micro-CT掃描ROI結果

2.3骨密度和骨礦含量的改變 骨質疏松組骨礦含量(BMC)和骨密度(BMD)分別顯著低于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 BMD和BMC測量結果

3 討 論

大部分人群在30歲以后體內骨量約以1%的速度逐年遞減，女性圍絕經期骨的吸收率明顯增強，丟失率每年可達 5%～10%〔4〕。目前認為，在各種因素(包括遺傳因素、環境因素、激素調控、物理因素、營養狀況等)作用下，使原本處于動態平衡的骨吸收和骨形成作用受到破壞，從而介導了骨質疏松的發生。

本實驗顯示，1～3個月是小鼠生長特別迅速的時期，以骨礦物含量、骨形態的增長最為明顯，而3個月以后骨骼的各項指標便趨于穩定，提示小鼠軀體已發育成熟〔5，6〕。由此可知骨質疏松的模型建立可選擇骨骼發育進入穩定期的3月齡小鼠。有學者選取1～5月齡小鼠作為實驗對象，研究小鼠的骨重、骨鈣指標等變化，得出與上述相似的結果〔7〕。目前建立骨質疏松模型常用方法有去勢建立模型和藥物誘導模型。去勢建立模型主要是人為摘除雄性小鼠睪丸或雌性小鼠卵巢〔8〕，模擬由性激素大幅降低引起的骨質疏松，鼠齡多選擇3～6個月，時間大多在去勢后4 w模型建立成功〔9〕。誘導骨質疏松的藥物常見的有糖皮質激素和維甲酸。糖皮質激素可采用肌肉注射的方法，其機制是增加破骨細胞活性，促進骨吸收，造模成功需5～6 w〔10，11〕；維甲酸灌胃誘導骨質疏松是構建急性或近期骨質疏松最常用的方法〔12〕。研究顯示，維甲酸可損傷性腺功能從而誘發骨質疏松〔13〕；也有學者研究顯示，維甲酸可增加成骨細胞數量，增強其活性，同時刺激破骨細胞活性，由此形成骨高轉換狀態〔14〕。前兩種方法的優點在于復制骨質疏松模型長遠效果好，缺點是小鼠死亡率略高，造模周期長；維甲酸灌胃優點是小鼠死亡率極低、經濟實惠、短時間內便可構建骨質疏松模型，缺點是骨質疏松長遠效果不佳。據文獻報道，采用高劑量(90 mg/kg)的維甲酸對小鼠連續灌胃7 d可有效構建急性骨質疏松〔3〕。

Micro-CT是一種無損傷分析骨結構很好的方法，可對小鼠是否造模成功提供重要依據。通過Mirco-CT對小鼠骨組織進行三維重建，不僅可以觀察到骨組織的微結構特征，還能通過骨小梁相關參數更直觀地反映骨組織的狀態〔15〕。本實驗通過Micro-CT可觀察到骨質疏松組小鼠符合骨質疏松影像學表象，由此可知維甲酸誘導3月齡的SPF級野生型C57小鼠建立骨質疏松動物實驗模型可靠。