TRM43355放線菌中蛋白對白色念珠菌生物膜形成的影響

袁琳琳 趙小亮 曾 紅*

（1新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，新疆阿拉爾843300）（2塔里木大學生命科學學院，新疆阿拉爾843300）

白色念珠菌（Canidia albicans）一種條件治病真菌，當機體免疫功能下降時，白色念珠菌將大量繁殖入侵機體細胞導致疾病發生［1］。菌群與上皮細胞表面的受體結合并分泌出胞外多糖或蛋白，形成的膜狀物，即生物膜。與浮游細胞相比，生物膜將自身包裹在自發粘附的多糖和蛋白質層中，使白色念珠菌粘附到表面，可防治藥物的殺菌作用［2］，具有抵抗更高水平的抗真菌劑的能力，并且可以產生對常用治療的耐受性［3］。生物膜的形成是白色念珠菌產生耐藥性的主要原因之一［4］。因此，篩選生物膜抑制劑的研究方向具有很大意義。

目前，治療白色念珠菌感染的藥物主要包括多烯，唑類，棘白菌素幾類［5-7］，其中每一類通過特定的方式達到相應的抗菌效果。但是每一類都有相應的缺點，不能完全根治。為了克服病原菌的耐藥性從微生物源次生代謝產物中尋找能抑制白色念珠菌生物膜形成的活性物質顯得尤為重要。

放線菌能夠產生豐富的代謝產物，是挖掘生物活性物質的天然寶庫。但是放線菌次生代謝產物的開發與利用只占總體的1%，還有99%未開發利用，對我們來說是很大的資源，尤其是鏈霉菌，受到特別關注。在這耐藥性增加的時代，微生物源代謝產物抑制生物膜的生長，而不殺死宿主細胞，可能為新藥的研發候選材料。基于前期預實驗發現放線菌TRM43355發酵液對白色念珠菌ATCC 64550的生物膜具有較好抑制作用，于是針對菌株TRM43355次級代謝產物進行深入研究。本實驗以白色念珠菌為靶標病原菌，以放線菌TRM43355為研究材料，放線菌TRM43355發酵液中粗蛋白通過硫酸銨鹽析法獲得粗蛋白，采用微孔板半定量法檢測活性物質對白色念珠菌生物膜形成的影響，確定其抑制白色念珠菌生物膜形成的活性物質。初步探索活性蛋白抑制白色念珠菌生物膜形成的最小生物膜清除濃度（MBEC）并研究不同理化因素（pH、溫度、金屬離子、有機溶劑）對蛋白活性的影響。

綜上所述，白色念珠菌作為目前比較常見的致病菌，對抑制其生物膜形成的物質研究較廣，本實驗從放線菌次級代謝產物中提取抑制白色念珠菌生物膜的蛋白并探索其環境條件，為抗真菌藥物的治療和抗膜劑新藥的研發奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗儀器

高速冷凍離心機，高壓滅菌鍋，電子天平，96孔板，恒溫振蕩儀，酶標儀

1.1.2 菌株來源

致病菌株：白色念珠菌ATCC 64550（Canidia albicansATCC 64550），購于美國典型培養物保藏中心ATCC。拮抗菌株：放線菌菌株TRM43355分離于新疆阿拉爾市塔克拉瑪干沙漠的流動風沙。

1.1.3 實驗培養基及試劑

高氏一號培養基（1 L）；AM6培養基（1 L）；YPD培養基；SDB培養基，培養見《微生物實驗指導》。

試劑：(NH4)2SO3；CuSO4·5H2O；FeSO4·7H2O；Mn-SO4·H2O；ZnSO4·7H2O；CH3OH。

1.2 方法

1.2.1 放線菌TRM43355的分類學鑒定

根據張仁文［8］等報道的用酶解法提取鏈霉菌基因組總DNA并進行16S rRNA基因的PCR擴增，并委托上海生物工程有限公司測序。使用EzTaxon數據庫與來自最密切相關的鏈霉菌屬物種的序列進行多重比對，以及序列相似性的計算。通過MEGA軟件中鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構建系統發育樹［9-10］，明確其分類學地位。

1.2.2 菌株TRM43355發酵液的制備

將放線菌菌株TRM43355接種于高氏一號固體培養基于37℃培養5-7 d。將單菌落接種于AM6液體發酵培養基，每瓶150 mL，37℃，180 r/min振蕩培養7-10 d。發酵液用紗布過濾，除去大顆粒的菌體，再用50 mL離心管，10000 r/min離心10 min，以備后續使用。

1.2.3 菌株TRM43355發酵液粗提物制備

將發酵液分別通過D-101大孔樹脂吸附［8］，分別用30%、50%、70%、95%甲醇洗脫，收集不同階段組分，膏狀50℃烘干備用。稱取適量浸膏用5%DMSO溶解，過0.22μm無菌微孔濾膜，-20℃待用。

1.2.4 菌株TRM43355發酵液粗蛋白提取

將放線菌菌株TRM43355的發酵液用紗布過濾后，10000 r/min離心10 min，收集上清，再按70%的濃度加入飽和硫酸銨［11］，置于攪拌30 min，4℃靜置過夜，10000 r/min低溫高速離心15 min，收集沉淀。用少量PBS（磷酸鹽緩沖液）溶解沉淀，用MW8000-10000的透析袋4℃透析48 h。奈氏試劑檢測透析液中的NH4+是否殘留。將無殘留PBS溶解的粗蛋白溶液冷凍抽干，存放-20℃備用。

1.3 活性檢測

1.3.1 不同蛋白濃度對白色念珠菌生物膜形成能力的影響

采用微孔板半定量方法［12］檢測蛋白對念珠菌生物膜形成能力的影響。用PBS配制蛋白母液濃度為2 mg/mL，經過0.22μm微孔濾膜過濾，置于96孔板中，進行倍性稀釋，獲得蛋白濃度為1000～3.91μg/mL［13-14］檢測不同蛋白濃度對白色念珠菌生物膜形成能力的影響。

1.3.2 菌株TRM43355發酵液產物和粗蛋白對白色念珠菌生物膜形成能力的影響

取100μL的菌株TRM43355發酵液分段產物溶液（30%、50%、70%、95%不同甲醇相組分浸膏）和100μL的菌液（將培養72 h白色念珠菌菌液按1：10稀釋，菌液濃度為1.205×107CFU/mL）加至96孔板中，混勻，4個孔為一組平行實驗。37℃培養箱靜置培養72 h后用酶標儀檢測生物生長量，蒸餾水沖洗三次，洗去未黏附的浮游真菌，60℃烘箱1 h，用0.5%結晶紫染色5 min，用蒸餾水沖洗后室溫下自然晾干，用酶標儀測定ATCC 64550白色念珠菌生物膜形成能力，相對生物膜形成能力=（處理組OD490/空白對照OD490）×100。

1.4 粗蛋白經過不同理化因素處理后對白色念珠菌生物膜形成能力的影響

1.4.1 粗蛋白經過不同pH處理后對白色念珠菌生物膜形成能力的影響

為探究不同pH值對蛋白穩定性的影響，分別用pH值為3、5、7、9、11的PBS（磷酸緩沖溶液）溶解樣品，配制最終濃度為2 mg/mL的粗蛋白溶液，0.22μm無菌微孔濾膜除菌，微孔板半定量法檢測不同pH值處理后的粗蛋白對白色念珠菌生物膜形成能力的影響。

1.4.2 粗蛋白經過不同溫度處理后對白色念珠菌生物膜形成能力的影響

為探究溫度對蛋白穩定性的影響，配制粗蛋白濃度為2 mg/mL，分別經過不同溫度（30℃、40℃、60℃、80℃、100℃）處理30 min，未經水浴處理的-20℃為未處理組。分別過0.22μm微孔濾膜，利用微孔板半定量法檢測不同溫度處理后的粗蛋白對白色念珠菌生物膜形成能力的影響。

1.4.3 粗蛋白經過不同金屬離子處理后對白色念珠菌生物膜形成能力的影響

為進一步探究粗蛋白的穩定性，用不同的金屬離子處理粗蛋白，金屬離子分別為Fe2+、Zn2+、Mn2+，Cu2+未經金屬離子處理的粗蛋白為未處理組。金屬離子配置母液濃度為5 mmol/mL，不同金屬離子溶液梯度稀釋，并加入100μL稀釋的菌懸液，混合均勻，37℃培養箱靜置培養72 h。利用微孔板半定量法檢測不同金屬離子處理后的粗蛋白對白色念珠菌生物膜形成能力的影響。

1.4.4 粗蛋白經過不同有機溶劑處理后對白色念珠菌生物膜形成能力的影響

用不同有機溶劑處理粗蛋白，探究蛋白的穩定性，選擇的有機溶劑分別為乙酸乙酯、氯仿、石油醚、丙酮。配制濃度為2 mg/mL蛋白溶液，按1：1比例加入有機溶劑（乙酸乙酯、氯仿、石油醚、丙酮）室溫下靜置2 h，自然風干至粉末。利用微孔板半定量法檢測不同有機溶劑處理后的粗蛋白對白色念珠菌生物膜形成能力的影響。

1.5 數據處理與分析

以上實驗數據均采用平均值±標準差形式表示以減少結果誤差，使用軟件Graphpad prism 5進行繪圖分析。

2 結果與分析

2.1 菌株TRM43355分類學鑒定

TRM 43355經過16S rRNA基因序列比對分析結果表明此菌株屬于鏈霉菌屬，與數據庫中Streptomyces barkulensisRC 1831T具有最高相似性，相似度為99.06%。與其它鏈霉菌屬種親緣關系如圖1所示。

圖1 菌株TRM43355基于16S rRNA基因序列鄰接法系統進化發育樹

2.2 發酵液不同組分及粗蛋白對白色念珠菌生物膜形成能力的影響

使用微孔板半定量法檢測發酵液的提取物對白色念珠菌ATCC 64550生物膜形成的影響。如圖2所示，菌株TRM 43355的粗蛋白對白色念珠菌生物膜形成具有很好的抑制效果，抑制率高達88.12%，其70%、95%甲醇洗脫分子的活性也比較顯著。后續實驗就放線菌TRM 43355發酵液中的粗蛋白深入研究。

圖2 菌株TRM43355發酵液提取物對白色念珠菌生物膜形成能力的影響

2.3 不同濃度粗蛋白對白色念珠菌生物膜形成的影響

為了確定菌株TRM 43355發酵液中蛋白對白色念珠菌生物膜形成的最小抑膜濃度，用不同濃度蛋白，采用微孔板定量法測試活性。如圖3所示，粗蛋白濃度為2 mg/mL時對白色念珠菌生物膜形成抑制率為93%。當蛋白濃度0.25 mg/mL、0.5 mg/mL和1 mg/mL時相對生物膜形成能力分別為96.31%、82.98%和86.89%，當蛋白濃度為2 mg/mL、2.5 mg/mL和3 mg/mL時相對生物膜形成能力分別為6.48%、7.71%和7.75%；蛋白濃度為0.25 mg/mL、0.5 mg/mL和1 mg/mL時幾乎不能達到抑制生物膜的效果，蛋白濃度為2 mg/mL、2.5 mg/mL和3 mg/mL時抑制生物膜的效果較好，抑制率可達90%以上，因此不同的蛋白濃度對白色念珠菌生物膜形成影響較大，蛋白濃度越高生物膜形成能力越弱，抑制率越強；濃度為2 mg/mL的蛋白濃度為最佳，繼而后續活性測試都采用蛋白濃度為2 mg/mL。

圖3 不同濃度粗蛋白對白色念珠菌生物膜形成能力的影響

2.4 粗蛋白經過不同理化因素處理后對白色念珠菌生物膜形成的影響

2.4.1 粗蛋白經不同pH處理后對白色念珠菌生物膜形成的影響

實驗為探討不同pH處理后的蛋白對白色念珠菌生物膜形成的影響，用不同pH處理蛋白，并進行活性檢測，pH值為7時處理的蛋白為未處理組，結果如圖4所示，當蛋白pH值為3時相對生物膜形成能力為6.57%；當蛋白pH值為5時相對生物膜形成能力為22.9%；當蛋白pH值為7時相對生物膜形成能力為39.79%；當蛋白pH值為9時相對生物膜形成能力為12.74%；當蛋白pH值為11時相對生物膜形成能力為19.58%。實驗結果發現，通過不同pH處理的粗蛋白對白色念珠菌生物形成能力的影響并不大，pH值為3時生物膜形成能力最差，其抑制白色念珠菌生物膜的活性最好，pH值為9時次之。

圖4 pH對粗蛋白抑制白色念珠菌生物膜形成能力的影響

2.4.2 粗蛋白經不同溫度處理后對抑制白色念珠菌生物膜形成的影響

實驗為探討溫度對蛋白質活性的影響，把溫度-20℃設為未處理組，處理組的溫度分別設置為：30℃、40℃、60℃、80℃和100℃，結果如圖5所示，當蛋白質經過-20℃處理后相對生物膜形成能力為33.3%，當蛋白質經過30℃處理后相對生物膜形成能力為13.39%，當蛋白質經過40℃處理后相對生物膜形成能力為11.07%，當蛋白質經過60℃處理后相對生物膜形成能力為9.88%，當蛋白質經過80℃處理后相對生物膜形成能力為87.89%，當蛋白質經過100℃處理后相對生物膜形成能力為97.43%。實驗結果可知當蛋白質經過80℃以上高溫處理后抑制白色念珠菌生物膜形成的活性基本喪失，故此80℃以上的高溫環境蛋白失活。

圖5 溫度對粗蛋白質抑制白色念珠菌生物膜形成能力的影響

2.4.3 粗蛋白經不同金屬離子處理后對白色念珠菌生物膜形成的影響

本實驗研究金屬離子對蛋白質活性的影響，所以需先探索金屬離子本身對生物膜的影響，見圖6，由圖6-a可知，當鐵離子濃度0.312 mmol/mL時對生物膜基本沒有影響，因此后續實驗選擇小于或等于0.312 mmol/mL；圖6-b，可知當鋅離子濃度為0.625 mmol/mL時幾乎沒有影響生物膜形成，故后續實驗選用鋅離子濃度小于或等于0.625 mmol/mL；由圖6-c可知，錳離子身就對生物膜形成幾乎沒有影響；實驗中還測試銅離子對生物膜形成的影響，但是銅離子無論濃度高低對生物膜形成有巨大影響，因此銅離子不做后續實驗，綜上所述最終金屬離子濃度統一為0.312 mmol/mL。不同金屬離子處理的粗蛋白對生物膜形成能力的影響如圖6-d所示，粗蛋白經鐵離子處理后其白色念珠菌相對生物膜形成能力14.06%；經錳離子處理后其生物膜形成能力為9.85%；經鋅離子離子處理后其生物膜形成能力為7.56%；未用金屬離子處理組其生物膜形成能力為39.79%。從實驗數據明顯發現Zn2+處理蛋白后抑制生物膜效果最好，抑制率高可達92.44%。

圖6 粗蛋白經不同金屬離子處理后對白色念珠菌生物膜形成能力的影響

2.4.4粗蛋白經不同有機溶劑處理后對白色念珠菌生物膜形成能力的影響

實驗為探討不同有機溶劑對蛋白活性的影響，結果如圖7所示，當蛋白經乙酸乙酯處理后，其白色念珠菌相對生物膜形成能力為6.75%；當蛋白質經氯仿處理后，其白色念珠菌相對生物膜形成能力為10.86%；當蛋白經石油醚處理后，其白色念珠菌相對生物膜形成能力為7.91%；當蛋白經丙酮處理后，其白色念珠菌相對生物膜形成能力為9.05%；未處理組為39.79%。以上結果表明粗蛋白經過有機溶劑處理過后抑制生物膜的活性都有所提高。

圖7 蛋白經不同有機試劑處理后對白色念珠菌生物膜形成能力的影響

3 結果與討論

生物膜起到屏障保護作用，使藥物很難作用菌群，因此生物膜的形成是白色念珠菌產生耐藥性主要原因之一。白色念珠菌對大部分抗真菌藥物產生多重耐藥性，這些使得白色念珠菌感染對人類健康產生更大的威脅。為了發現和開發低毒性和高治療活性的新型抗真菌劑，專家們試圖從天然產物（植物，動物，微生物）中尋找。例如植物來源的姜黃素［15］，厚樸酚［16］，和厚樸酚［17］，檸檬烯［18］等對白色念珠菌生物膜的形成具有較好的抑制作用；動物來源的蛙皮抗菌肽-S1可抑制白色念珠菌生物膜的形成［19］；微生物來源的土壤鏈霉菌菌株98%乙醇提取物［20］，冠霉素鏈霉菌ADP4乙酸乙酯粗提取物［21］、海洋細菌枯草芽孢桿菌的5-羥甲基-2-糠醛（5HM2F）［22］、糞腸球菌細菌素 EntV［23］等對白色念珠菌的生物膜也具有較好的抑制效果。天然衍生的化學抗真菌劑是一種有吸引力的選擇，特別是那些微生物衍生的分子，由于它們對機體的刺激性小，毒性小，同時也不易使病原菌發現采取防護措施。目前開發的大部分抗生素都源于放線菌，它被廣泛認為是新抗生素產生菌群的重要菌種，是開發價值相當高的一類微生物。

本實驗以一株分離于新疆塔克拉瑪干沙漠流動風沙的放線菌為研究對象，采用微孔板半定量法檢測該菌株發酵液不同組分及粗蛋白對白色念珠菌ATCC 64550生物膜形成的影響，活性最好得部位為粗蛋白，其抑膜率達到88.12%，因此針對菌株TRM 43355發酵液粗蛋白抑制白色念珠菌生物膜形成做如下探究。

對放線菌TRM43355發酵液粗蛋白抑制白色念珠菌生物膜形成的最小抑膜濃度［24］進行初步探索，測得菌株TRM43355代謝產物蛋白對白色念珠菌生物膜的最小抑膜濃度為2 mg/mL。并探究pH、溫度、金屬離子等不同理化因素對蛋白活性的影響。探究pH對蛋白活性的影響時發現通過不同pH處理后粗蛋白對白色念珠菌生物膜形成能力的影響并不大。pH值為3時處理的粗蛋白生物膜形成能力最低，其抑制膜活性最高，pH值為9時次之。探究溫度對蛋白活性的影響時發現當粗蛋白經過60℃水浴處理后生物膜形成能力最低，抑膜率達到90%以上，但是當蛋白質經過80℃以上高溫處理后抑膜的作用基本喪失，說明80℃以上的高溫環境能使活性蛋白失活，故此可判斷該蛋白不耐高溫。探究金屬離子對蛋白活性的影響時，首先探索金屬離子本身對生物膜的影響，發現錳離子本身對生物膜形成沒有影響，鐵離子和鋅離子濃度在小于或等于0.312 mmol/mL時對生物膜基本沒有影響，但Cu2+任何濃度對生物膜的形成有影響，經查閱胡學偉等Cu2+對生物膜及其胞外聚合物的影響［25］，可知Cu2+會與生物膜上的胞外多糖結合，從而抑制了生物膜生長，與本實驗結論相近，因此不討論銅離子對蛋白的活性影響。經過鋅離子處理的蛋白抑制生物膜活性為最佳，錳離子次之，未處理組最差，說三種明金屬離子（Fe2+，Zn2+，Mn2+）均能促進蛋白抑膜效果。以上結果和經有機溶劑（乙酸乙酯，氯仿，石油醚，丙酮）處理過的蛋白效果相同，至于為什么加入金屬離子和不同有機溶劑能達到促進的效果值得進一步的研究。本論文的研究拓展了菌株TRM43355代謝產物蛋白有較高的抑制白色念珠菌生物膜形成的活性，并初步探索其蛋白質經不同理化因素處理后的活性變化，為尋找抑制白色念珠菌生物膜形成的活性物質提供了更多的方向。