藏雞MyoG基因的表達及其與經濟性狀的相關分析

郭賽

（湖北師范大學 生命科學學院，湖北黃石 435002）

藏雞多生長在低氣壓（57.7 kPa)、缺氧（氧分壓為11.9 kPa）的惡劣環境下，因而生長緩慢，產蛋量較少。27.5%的氧濃度使得低海拔雞品種在高海拔地區孵化率高達88.7%[1]，結合這一特點，我國引入大量品質優良、生長迅速的外國雞種，與本土藏雞進行雜交，培育出易于養殖、生長周期短的新藏雞品種品系。

研究表明，MyoG基因位于MyoD和Myf5的下游，具有使生肌細胞向肌小管分化的獨特功能[2]。MyoG與MRF4具有同源性，是控制肌肉分化且唯一在所有骨骼肌細胞系中均可表達的基因，是骨骼肌分化所必需的因子，通過控制肌細胞的融合和肌纖維的形成來對肌肉的形成起到關鍵作用[3-5]。本研究探討藏雞的MyoG（肌細胞生成素）在不同日齡、性別藏雞的胸肌和腿肌的表達及其與經濟性狀的相關性，為藏雞在保持原優良性狀的基礎上進一步培育與改良提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本次實驗所選取的藏雞來自于中國四川省彭州市藏雞養殖基地，挑選采集日齡分別在0、81、119、156、210 d的藏雞共計150只，按不同的發育程度分為5組，每組30只，其中15只雄性、15只雌性。

在統一飼養的條件下，藏雞自由飲水采食。屠宰前禁食12 h，通過放血法進行屠宰，快速取其右側胸肌、腿肌置于液氮中，帶回實驗室儲存在-80 ℃備用。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取

（1）取 60 mg肌肉組織至研缽，加入 500 μL Trizol充分研磨均勻，取 0.1 g放入 RNase free 1.5 mL離心管中。

（2）再次添加 500 μL Trizol，漩渦振蕩，室溫下靜置 10 min。

（3）加入 0.2 mL Trizol的氯仿，用振蕩器劇烈振蕩 15 s，室溫放置 3 min。

（4）4 ℃下，12 000g（14 000 r/min）離心 15 min。離心分層，取上層水相移至另一個 RNase free 1.5 mL離心管中，加 0.5 mL 異丙醇，上下顛倒，靜置 10 min。

（5）4 ℃下，12 000g（14 000 r/min）離心 10 min。

（6）吸去上清液，加入一倍體積的75%乙醇溶液，洗滌沉淀。

（7）4 ℃下，7 500g，離心 5 min。棄去上清液，曬干靜置 10 min。

（8）加入20 μL DEPC處理水，防止RNA降解。

（9）溶于DEPC處理水中，于-70 ℃下冷凍保存。

1.2.2 RNA的定量

（1）每種肌肉組織的RNA樣品各取3份，放入RNase free 1.5 mL 離心管中。

（2）在離心管中加入溶解液，稀釋RNA，并記錄稀釋比例。

（3）以溶解液作空白對照，使用紫外分光光度計測量RNA的濃度，測量結果乘以稀釋比例即為樣品濃度。

（4）多次測量，取其測量結果的平均值，得到全部樣品的RNA濃度值，并記錄實驗數據。

（5）用移液槍及RNase free槍頭測量各個肌肉組織RNA的體積，并計算各樣品中加入的RNase-Free Water體積，從而將RNA樣品的濃度全部調節一致，調整為100 ng/μL。定量后RNA樣品濃度的誤差將小于5%。

1.2.3 反轉錄合成cDNA第一鏈

（1）在逆轉錄酶的作用下采用RT-PCR技術合成cDNA。

（2）配制RT-PCR反應液，振蕩混勻，瞬時離心。反應液各成分及加入量見表1。

表1 RT-PCR反應混合物組成

（3）PCR 儀反應條件設置為 37 ℃、15 min，進行反轉錄操作，反轉錄結束，在85 ℃、5 s反應條件下使反轉錄酶失活。

（4）取 0.2 mL PCR 管，依次加入第一鏈 2 μL cDNA、1 μL 上游引物（10 μmoL/L）、1 μL 下游引物（10 μmoL/L）、10 μL PerfectShot Taq 和 6 μL滅菌去離子水。振蕩混勻離心。

（5）進行PCR反應，反轉錄PCR程序見表2。

表2 反轉錄MyoG基因的PCR反應程序

1.2.4 熒光定量PCR

（1）置于冰上加入PCR反應體系。檢測內參基因和目的基因。

（2）5倍稀釋cDNA溶液，開始點樣，然后蓋緊8連管蓋，瞬時離心。

（3）打開樣品槽，將PCR管放入PCR儀進行擴增，調用 PCR 程序：預變性 95 ℃，30 s，變性 95 ℃，5 s，退火 60 ℃，34 s，45 個循環，最后加上溶解程序，然后開始運行。

1.3 數據分析

采用ANOVA程序分析評估不同肌肉組織、性別間MyoG基因表達的差異。建立模型，從而分析MyoG基因的表達與藏雞生長性狀以及胴體性狀的相關性。實驗結果數據用Mean± SEM的形式表示，P＜0.05為存在差異，P＜ 0.01為存在顯著差異。

2 結果與分析

2.1 MyoG基因在藏雞不同日齡的表達情況

藏雞胸肌和腿肌中MyoG基因表達結果見圖1。在胸肌中，隨著日齡的增加，無論雄性雞和雌性雞MyoG基因表達水平從開始至81日齡急劇下降，隨后一直保持小幅度波動，在210日齡達到較低的水平。

在腿肌中，雄性雞和雌性雞在開始到81日齡時，MyoG基因表達水平小幅度降低，隨后，雌性雞的基因表達水平急劇上升，在119日齡達到峰值。從119～154日齡，基因表達水平再次急劇下降，從154日齡至210日齡小幅降低。而雄性雞MyoG基因表達水平自81日齡緩慢上升，在119日齡到154日齡保持恒定，從154日齡至210日齡小幅上升。

119、154、210日齡雄性藏雞MyoG基因在胸肌和腿肌表達有顯著差異，119日齡時水平最低（P＜0.05或P＜0.01）；在0，81日齡時無顯著差異。

119日齡雌性藏雞MyoG基因在胸肌和腿肌間表達差異顯著；在0、81、154、210日齡時無顯著差異。

相同日齡的雄性和雌性藏雞在胸肌中MyoG基因表達無顯著差異。僅119日齡的雄性和雌性藏雞腿肌MyoG基因表達差異顯著。

圖1 藏雞MyoG基因5個日齡表達圖

2.2 MyoG基因表達與經濟性狀的相關性

見表3，在雄性雞胸肌中MyoG基因表達與脛圍存在相關關系，與其他性狀無顯著相關。在雄性雞胸肌中MyoG基因與各項性狀無明顯關聯。

MyoG基因的表達與各胴體性狀間的顯著性概率均大于0.05（P＞0.05)，因此，無論雄性雞雌性雞在胸肌與腿肌中MyoG基因與胴體性狀無顯著相關，見表4。

表3 MyoG基因表達與生長性狀R的相關性（P值）

表4 MyoG基因表達與胴體性狀的相關性

3 討論

本研究發現，隨著日齡的增長，無論雄性雞或雌性雞，MyoG基因在胸肌中的表達量從0日齡時的最高開始急劇減少，且在81、119、154、210日齡這4個階段保持穩定。但在腿肌中，雌性雞MyoG基因表達量的峰值是在119日齡，而雄性雞MyoG基因表達量的峰值則是在210日齡，且不同性別之間，MyoG基因在腿肌的表達情況存在較大差異。據此可推測，MyoG基因在胸肌的表達可能與藏雞性別特異性有關。

而在探討MyoG基因與經濟性狀裝的相關性時發現，除了在雄性雞胸肌中MyoG基因表達與脛圍存在相關關系，與體斜長、胸骨長、脛骨長、盆骨寬等生長性狀均無顯著相關。而雌性雞無論胸肌或是腿肌中MyoG基因表達均與生長性狀無顯著相關性。由此可見，MyoG基因與雄性雞生長性狀的相關性大于雌性雞，本研究所選取的研究對象發育階段和分析對象需要我們進一步擴大樣本。