滋補脾陰方藥對脾陰虛大鼠空腸組織黏蛋白表達的影響

侯圣林 戰麗彬 孫曉霞

摘要：目的? 觀察滋補脾陰方藥對脾陰虛大鼠空腸組織黏蛋白（MUC）表達的影響，探討其相關作用機制。方法? 將大鼠隨機分為正常對照組、模型組和滋補脾陰方藥組。采用復合方法建立脾陰虛證動物模型，連續38 d，滋補脾陰方藥組于造模第25～38日予滋補脾陰方藥藥液灌胃，正常對照組和模型組予生理鹽水灌胃。免疫組化觀察大鼠空腸組織MUC的表達。結果? 與正常對照組比較，模型組大鼠空腸組織MUC2蛋白表達有降低趨勢，MUC3和MUC5AC蛋白表達明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，滋補脾陰方藥組大鼠MUC2蛋白表達有上調趨勢，MUC3蛋白表達明顯降低（P<0.001），MUC5AC蛋白表達有下調趨勢。結論? 滋補脾陰方藥可改善脾陰虛模型大鼠MUC的表達。

關鍵詞：脾陰虛;滋補脾陰方藥;黏蛋白;空腸;大鼠

中圖分類號：R285.5??? 文獻標識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）08-0051-03

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.08.011????? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Objective To observe the effects of Zibu Piyin Recipe on MUC expression in rats with spleen-yin deficiency; To discuss the relevant mechanism of action. Methods The rats were randomly divided into normal control group， model group and Zibu Piyin Recipe group. The animal model of spleen-yin deficiency syndrome was established by compound method for 38 days. Zibu Piyin Recipe group was given Zibu Piyin Recipe for gavage during d25-d38 of modeling， the normal control group and the model group were given nornal saline for gavage. The expression of MUC of colon tissues was observed by immunohistochemistry. Results Compared with the normal control group， the expression of MUC2 protein in the model group was has a downward trend， and the expressions of MUC3 and MUC5AC protein increased （P<0.05）. Compared with the model group， the expression of MUC2 protein in Zibu Piyin Recipe group was has an upward trend. Expression of MUC3 protein was significantly decreased （P<0.001）， and expression of MUC5AC protein was has a downward trend. Conclusion Zibu Piyin Recipe can improve the MUC expression of spleen-yin deficiency model rats.

Keywords： spleen-yin deficiency syndrome; Zibu Piyin Recipe; mucin; jejunum; rats

中醫學理論認為，脾的功能為運化水谷、輸布水液和精微物質，又具有統攝血液的作用，故“脾為后天之本”。脾陰虛的病理變化表現在運化失司、營陰不足、陰虛內熱等。脾的生理功能會直接影響機體防御疾病的能力，因而有“脾主為衛，脾虛則百病內生”的說法[1]。黏蛋白（mucin，MUC）廣泛存在于消化道，維持黏液保護層厚度及膠體形態，潤滑腸道，在胃腸黏膜的防御和修復過程中扮演著重要角色。胃腸黏膜的防御屏障機制與中醫的“脾主為衛”有著相同生理病理基礎。這種聯系表明胃腸黏膜的防御功能減弱可能與脾胃生理功能減退有關。提示脾胃的防衛功能不僅與全身免疫功能有關，而且與胃腸黏膜本身的防御屏障功能有關。因此，本實驗觀察滋補脾陰方藥對脾陰虛大鼠空腸MUC2、MUC3和MUC5AC蛋白表達的影響，探討其相關作用機制。

1? 材料與方法

1.1? 動物

健康Wistar雄性大鼠18只，體質量（200±20）g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SCXK（京）2012-0001。飼養于南京中醫藥大學SPF級動物房，室溫18～23 ℃，相對濕度45%～55%，明暗12 h交替。

1.2? 藥物

滋補脾陰方藥（紅參30 g，蓮肉20 g，山藥15 g，茯苓15 g，白芍15 g，白扁豆15 g，丹參12 g，石菖蒲10 g，遠志10 g，檀香4.5 g，橘紅9 g，炙甘草9 g），飲片購于大連醫藥集團藥材公司，常規水煎，每毫升藥液含原藥材3.29 g，過濾后4 ℃冰箱保存備用。傷陰藥（制附子、吳茱萸、肉桂按1∶1∶1混合），飲片購于南京中醫藥大學國醫堂，常規水煎，每毫升藥液含原藥材1 g，過濾后4 ℃冰箱保存備用。

1.3? 主要試劑與儀器

MUC（MUC2、MUC3、MUC5AC）免疫組化試劑盒（美國Abcam公司）。AC8洗板機（美國Thermo Labsystem公司），ASP300S全自動真空組織脫水機（德國Leica公司），Image Pro Plus 5.0.2免疫組化圖像分析軟件。

1.4? 分組、造模及給藥

18只Wistar雄性大鼠隨機分為正常對照組、脾虛模型組。適應性喂養3 d，自由攝食飲水。采用復合因素（飲食不節、勞倦過度與耗傷陰液等）方法建立脾陰虛模型[2]。脾氣虛模型階段：采用飲食不節與力竭游泳相結合的方式，即先飽食1 d，再禁食2 d，3 d為1個循環，實驗期間自由飲水;每日1次，水溫保持22 ℃游泳至力竭，連續14 d。脾陰虛模型階段：第15日，將脾氣虛證造模成功大鼠每日增加傷陰藥藥液1 mL/100 g灌胃。正常對照組予等體積生理鹽水灌胃。滋補脾陰給藥階段：第25～38日將脾陰虛模型組分為模型組和滋補脾陰方藥組，其中滋補脾陰方藥組每日予滋補脾陰方藥藥液1 mL/100 g灌胃，正常對照組和模型組予等體積生理鹽水灌胃。每日詳細記錄大鼠體質量、肛溫、飲水量及進食量，并觀察大鼠糞便及毛發色澤等。

1.5? 模型評估

參考《中醫虛證辨證參考標準》[3]及《中醫新藥臨床研究指導原則（試行）》[4]。在脾氣虛造模狀態下，大鼠出現食少、消瘦、神疲乏力、毛色枯槁無光澤，便溏或軟，并且游泳耐力下降，表明脾氣虛模型建立成功。脾陰虛造模狀態下，大鼠出現體質量下降、易暴躁、易激怒、時有咬斗、肛溫升高、糞便干燥、毛發枯槁無光澤、進食量時增時減和飲水量增多等現象，表明脾陰虛模型建立成功。

1.6? 標本制備

末次給藥后，2%戊巴比妥鈉麻醉，大鼠腹主動脈取血，冰上迅速摘取空腸組織，分成50～100 mg小塊，4%多聚甲醛固定，常規脫水，石蠟包埋，切片。

1.7? 免疫組化檢測空腸組織黏蛋白表達

按免疫組化試劑盒說明書進行操作。實驗步驟：石蠟切片常規脫蠟至水，PBS洗2次×5 min，抗原修復。用蒸餾水或PBS配制新鮮3%H2O2，室溫封閉10 min，蒸餾水洗1次。PBS沖洗5 min，滴加5%牛奶封閉液，室溫10 min。甩去多余液體，滴加一抗，4 ℃過夜（過夜后37 ℃復溫45 min）。PBS洗2次×5 min，滴加生物素化二抗，37 ℃孵育30 min。PBS洗2次×5 min，滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈霉菌抗生物素溶液，37 ℃孵育20 min。PBS洗2次×5 min，DAB顯色3～10 min，鏡下觀察染色程度。蒸餾水沖洗終止染色，蘇木素復染2 min。分化后透明、封片，待鏡檢。

1.8? 統計學方法

采用SPSS19.0統計軟件進行分析。實驗數據用—x±s表示，采用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

2? 結果

免疫組化檢測結果顯示，大鼠空腸組織棕黃色區域為MUC陽性表達（見圖1～圖3）。與正常對照組比較，模型組大鼠MUC2蛋白表達有降低趨勢，MUC3和MUC5AC蛋白表達明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）;與模型組比較，滋補脾陰方藥組大鼠MUC2蛋白表達有上調趨勢，MUC3蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義（P<0.001），MUC5AC蛋白表達有下調趨勢。見表1。

3? 討論

脾為“倉廩之官”“后天之本”，機體很多疾病的產生都與脾虛有一定聯系。脾為五臟六腑之本，脾失健運，不能運化水谷精微，提示機體處于脾虛狀態時，機體胃腸黏膜防御功能下降。現代研究認為，脾是以消化系統為基礎的，包括能量代謝與水液代謝，并與血液、內分泌、免疫和神經系統等有著密切聯系的一個醫學概念，是一個多系統、多器官的功能單位。有研究者認為，脾虛涵蓋了機體多個系統以及系統的多個功能的異常，其主要特征是消化系統形態與功能的異常[5]。脾為太陰，乃三陰之長，脾陰是指藏于脾中的由水谷精微所化生的營血津液等精微物質，是人體陰液的一部分，也是脾臟功能活動的物質基礎。脾陰生理功能主要表現在運化濡養、統攝血液和制約陽熱等方面，脾陰病理表現主要包括運化失司、陰虛內熱、營陰不足等。其主要癥狀為：食少腹脹，食后尤甚，大便溏薄或秘結、溏結不調，口干舌燥，形體消瘦，面色無華，倦怠乏力，手足心熱，舌紅少津，苔少或無，脈細無力[6]。滋補脾陰方藥是戰麗彬教授在《不居集》資成湯基礎上結合自身多年臨床實踐化裁而成[7]，方中人參補益脾氣以助脾陰，山藥培補脾元，白扁豆、茯神滋陰補脾，白芍柔肝健脾，佐以蓮肉、丹參交通心腎。全方以培補后天、滋補脾陰為立方原則，所含藥物具有質地濡潤、生津化液、補而不燥、滋而不膩、守中化陰、不礙升運的特點。

MUC主要存在于胃腸道、乳腺、胰腺上皮細胞中，是由杯狀上皮細胞合成分泌的大分子量糖蛋白，至今已發現21種MU。根據MUC不同的功能或特點可分為不同種類，依據其生理學特點可分為膜結合型、分泌型、可溶性MUC。這3種MUC主要區別在于是否具有跨膜區。膜結合型MUC主要分布在細胞表面或胃腸上皮黏液中，MUC3存在于跨膜區、胞質尾區和廣泛的胞外區。分泌型MUC多由凝膠形式存在，MUC2、MUC5AC形成低聚物結構。可溶性MUC屬非凝膠形式MUC。MUC具有多種功能，結構不同所具有的功能也不盡相同。MUC2主要存在結腸、空腸中，是腸道黏液的組成部分。MUC3是由小腸、結腸絨毛上皮細胞分泌的，是一種跨膜MUC。MUC5AC主要表達于胃黏膜，目前研究發現在一些病理情況下也會表達于腸黏膜[8]。MUC對腸黏膜上皮具有保護作用，在腸道黏膜防御中發揮積極作用，同時，MUC分泌本身還可起到潤滑作用[9]。

本實驗結果表明，模型組大鼠較正常對照組空腸組織MUC2蛋白表達有下調趨勢，滋補脾陰方藥組空腸組織MUC2蛋白表達有上調趨勢;模型組大鼠空腸組織MUC3和MUC5AC蛋白均有明顯表達，滋補脾陰方藥組空腸組織MUC3蛋白表達較模型組明顯降低，MUC5AC蛋白表達也有下調趨勢。

綜上所述，脾陰虛狀態下，空腸黏膜分泌MUC2出現下降趨勢，空腸黏膜分泌MUC3、MUC5AC增加，經滋補脾陰方藥治療后，MUC2分泌又出現增加趨勢，MUC3表達明顯降低，MUC5AC表達也出現下調趨勢。這提示滋補脾陰方藥可能有改善脾陰虛大鼠空腸黏膜的屏障作用。

參考文獻：

[1] 張博.脾虛大鼠腸黏膜屏障功能變化及四君子湯對其影響的實驗研究[D].沈陽：遼寧中醫藥大學，2014.

[2] 戰麗彬，劉莉，宮曉洋，等.脾陰虛癡呆證病結合模型建立及滋補脾陰方藥干預的實驗研究[J].中華中醫藥學刊，2008，26（1）：9-12.

[3] 沈自尹，王文健.中醫虛證辨證參考標準[J].中西醫結合雜志，1986， 6（10）：598-600.

[4] 鄭筱萸.中藥新藥臨床研究指導原則（試行）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2002：354-355.

[5] 劉曉玲.補中益氣湯對脾虛大鼠胃粘膜TFF1表達及MEK/ERK通路的影響[D].廣州：廣州中醫藥大學，2011.

[6] 王憶勤.中醫診斷學[M].北京：中國中醫藥出版社，2004：164.

[7] 胡守玉，梁麗娜，戰麗彬，等.滋補脾陰方藥對脾陰虛糖尿病大鼠大腦皮質內質網應激的影響[J].中國中醫藥信息雜志，2014，21（1）：46-49，53.

[8] 于秀文，趙春明，胡南.粘蛋白MUC2、MUC5AC在大腸腺癌中的表達及意義[J].中國醫療前沿，2013，8（7）：26-27.

[9] SHEKELS L L， HO S B. Characterization of the mouse Muc3 membrane bound intestinal mucin 5 coding and promoter regions： regulation by inflammatory cytokines[J]. Biochim Biophys Acta，2003， 627（2/3）：90-100.

（收稿日期：2018-12-22）

（修回日期：2019-01-15;編輯：華強）