馬錢子堿納米結構脂質載體的表征及體外釋放行為分析

管慶霞 張悅 鄒淑君 孫爽 于欣 張偉兵 華曉丹 楊志欣 李秀巖 王艷宏

摘要：目的? 制備馬錢子堿納米結構脂質載體，對其進行表征，并探討其體外釋藥規律。方法? 采用溶劑乳化超聲法制備馬錢子堿納米結構脂質載體。透射電鏡觀察其微觀形態;Malvem激光粒度分析儀測定其粒徑、Zeta電位及多分散指數（PDI）;差熱分析法分析馬錢子堿在載體中的存在形態;動態膜透析法研究馬錢子堿納米結構脂質載體的體外釋放行為，采用HPLC測定馬錢子堿含量，比較馬錢子堿溶液與馬錢子堿納米結構脂質載體84 h內的累積釋放度，并考察馬錢子堿納米結構脂質載體的釋藥機制。結果? 馬錢子堿納米結構脂質載體透射電鏡下為完整的類球形實體粒子;粒徑為（137.20±1.11）nm，PDI為0.14±0.05，Zeta電位為（-34.40±0.32）mV;差熱分析結果表明馬錢子堿以分子態或不定形狀態存在于載體中;體外釋藥曲線符合Higuchi方程（R2=0.965 9），藥物釋放量于60 h趨于飽和，累積釋放量接近87%。結論? 馬錢子堿納米結構脂質載體制劑學性質良好，且與馬錢子堿溶液相比具有明顯的體外緩釋作用。

關鍵詞：馬錢子堿;納米結構脂質載體;動態膜透析法;體外釋放;高效液相色譜法

中圖分類號：R283.5;R285.5??? 文獻標識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）08-0066-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.08.014????? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Objective To prepare Brucine nanostructure lipid carrier （NLC）; To characterize Brucine NLC; To study in vitro release characteristics of Brucine NLC. Methods Ultrasound emulsification solvent method was used to prepare the Brucine NLC. The microscopic morphology was observed by transmission electron microscopy; the particle size， Zeta potential and polydispersity index （PDI） were measured by Malvem laser particle size analyzer; DTA was used to analyze the presence of Brucine in the carrier; dynamic dialysis method was used to conduct the study on in vitro release of Brucine NLC. HPLC was used to determine the content of Brucine. Accumulative release rates of Brucine solution and Brucine NLC within 84 h were compared， and the drug release behaviors of Brucine NLC were investigated. Results Brucine NLC was observed under transmission electron microscopy as a complete spheroidal solid particle. The average particle size was （137.20±1.11） nm; PDI was 0.14±0.05; Zeta potential was （-34.40±0.32） mV. DTA results showed that Brucine existed as molecular or amorphous state in the NLC; the release curve of lyophilized powder was Higuchi equation （R2=0.965 9）; cumulative release was almost saturated within 60 hours; the cumulative release percentage was nearly 87%. Conclusion Brucine NLC has good formulation properties， and has a significant in vitro sustained release effect compared with Brucine solution.

Keywords： Brucine; nanostructure lipid carrier; dynamic membrane dialyse method; in vitro release; HPLC

馬錢子為馬錢科植物馬錢Strychnos nux-vomica L.的干燥成熟種子，馬錢子堿為其有效化學物質，同時也是毒性成分，是一種呈弱酸性的吲哚類生物堿[1]。馬錢子堿具有抗炎、鎮痛、抗腫瘤及增強機體免疫力等作用[2-3]，是一種高效的抗腫瘤單體，但因水溶性差、具有毒性等缺點[4-5]，制約其臨床應用。如何將藥物導向于肝，使其更好地服務于臨床，已成為目前亟需攻克的難題。納米結構脂質載體（nanostructure lipid carrier，NLC）是為了克服固體脂質納米粒的不足，采用納米技術對其進行修飾而開發的一種可負載活性成分的新型載體系統，具有毒性低、可控釋藥物、靶向性好、載藥量大、避免藥物降解與泄漏等特點[6-8]。其包載藥物后經靜脈注射入血，能夠將包載的藥物濃集于肝、脾，降低藥物在其他組織中的分布。本課題組前期已經成功制備了馬錢子堿NLC[9]，本研究在此基礎上對其制劑學性質進行研究。

1? 儀器與試藥

Waters e2695-2698高效液相色譜系統（美國Waters公司），AB265-S分析電子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司），Autotune高強度超聲波細胞破碎儀（美國SONICS公司），DF-101Z恒溫磁力攪拌器（鄭州長城科工貿有限公司），Zetasizer Nano-ZS90激光粒度分析儀（英國馬爾文儀器有限公司），SB-5200D超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司），WTC-1D/2D微機差熱天平（北京博飛儀器有限公司），Tecnai高分辨型透射電子顯微鏡（荷蘭飛利浦公司），HZS-HA水浴振蕩器（哈爾濱東聯電子技術開發有限公司），透析袋（MW 8000～14 400，美國Sigma公司）。

馬錢子堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110706-200505，純度≥98%），馬錢子堿原料藥（日本和光純藥株式會社，批號059-17，純度≥98%），泊洛沙姆188（德國BASF公司，批號WOPG565B），磷鎢酸（天津致遠化學試劑有限公司），Sephadex G-50葡聚糖凝膠（50～150 μm，上海浩然生物技術有限公司）;甲醇為色譜純，單硬脂酸甘油酯、油酸、無水乙醇等為分析純，水為蒸餾水。

2? 方法與結果

2.1? 納米結構脂質載體制備

稱取單硬脂酸甘油酯30 mg、油酸25 mg，置于燒杯中，加入無水乙醇2 mL，于60 ℃水浴條件下使其完全溶解，在恒溫磁力攪拌作用下加入馬錢子堿對照品1.28 mg，混勻，作為油相;量取濃度為1%的泊洛沙姆188 20 mL至另一燒杯中，于恒溫水浴中加熱到60 ℃，作為水相;將油相在60 ℃恒溫磁力攪拌作用下緩緩滴加到水相中，滴加完畢后，超聲3 min（功率750 W，頻率20 kHz），繼續室溫攪拌45 min，揮去無水乙醇，即得馬錢子堿NLC混懸液。

同時，以相同方法制備不含馬錢子堿的空白NLC混懸液。

2.2? 形態學觀察

取適量馬錢子堿NLC，用蒸餾水稀釋至適當濃度，滴至覆蓋支持膜的銅網上，用濾紙吸去過量液體，放至自然干燥，滴加2%磷鎢酸染色約30 s，置于透射電鏡下觀察，結果見圖1。可見，制備的馬錢子堿NLC呈完整的類球形實體粒子，粒子之間無明顯粘連，且分布較均勻。

2.3? 粒徑及Zeta電位測定

取馬錢子堿NLC適量，用蒸餾水稀釋至適宜濃度，輕搖振蕩，使其均勻分散，放入樣品池中，使用激光粒度分析儀測定樣品平均粒徑、多分散性指數（PDI）和Zeta電位，各樣品平行測定3次。結果顯示，馬錢子堿NLC的粒徑為（137.20±1.11）nm，PDI為0.14±0.05，Zeta電位為（-34.40±0.32）mV，粒徑呈正態分布。

2.4? 包封率及載藥量測定

參考本課題組前期建立的方法[10]測定馬錢子堿NLC包封率和載藥量，結果顯示，平均包封率為（67.96±3.11）%，平均載藥量為（1.81±0.04）%。

2.5? 差熱分析

分別取適量馬錢子堿對照品、空白NLC、馬錢子堿NLC、馬錢子堿和空白NLC的物理混合物，于WTC-1D/2D微機差熱天平，設置升溫速度為10 ℃/min，從室溫升至500 ℃，進行差熱分析實時監控掃描，結果見圖2。可以看出，馬錢子堿對照品的特征熔點峰為178 ℃，馬錢子堿和空白NLC的物理混合物出現馬錢子堿特征熔點峰，而馬錢子堿NLC的馬錢子堿特征熔點峰消失，表明馬錢子堿以非結晶態存在于馬錢子堿NLC內，可能為分子態或不定形狀態。

2.6? 體外釋放介質考察

2.6.1? 透析袋前處理

戴手套將透析袋剪為適宜長度的小段，先用大量50%乙醇煮沸1 h，再依次用50%乙醇、0.01 mol/L碳酸氫鈉和1 mmol/L EDTA（pH=8.0）溶液洗滌，最后用蒸餾水徹底洗凈，放入含50%乙醇的蒸餾水中，置4 ℃冰箱內保存備用，保存過程中確保透析袋完全浸沒在溶液內，使用前于釋放介質中浸泡24 h。

2.6.2? 釋放介質選擇

文獻報道馬錢子堿在PBS中的溶解度隨著乙醇含量的增加而增加[11-12]，故選擇分別含10%、20%、40%乙醇、pH 7.4的PBS，以及含0.1%吐溫-80、pH 7.4的PBS，進行穩定性和溶解度的考察。結果表明，馬錢子堿在40%乙醇、pH 7.4的PBS中溶解度最高，但是考慮到乙醇可使馬錢子堿NLC混懸液破乳，若乙醇含量過高則可能影響馬錢子堿NLC的穩定性，最終選擇含20%乙醇、pH 7.4的PBS作為釋放介質，既可達到漏槽條件，又不影響馬錢子堿NLC混懸液的穩定性。

2.6.3? 釋放介質穩定性考察

精密量取5 mg馬錢子堿對照品，溶于50 mL含20%乙醇、pH 7.4的PBS，置于具塞溶出瓶中，設置恒溫水浴振蕩器溫度為（37.0±0.2）℃，振搖速度為（100±2）r/min，在0～48 h時間段內抽樣測定藥物的峰面積，結果峰面積RSD=0.98%（n=9），表明在設定的溫度與時間內，藥物與釋放介質的穩定性均滿足測定要求。

2.7? 體外釋放分析方法的建立

2.7.1? 色譜條件

采用Dikma C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇∶水-乙酸-三乙胺（230∶2.4∶0.3）=30∶70，檢測波長為265 nm，流速1 mL/min，進樣量10 μL，柱溫30 ℃。

2.7.2? 對照品貯備液制備

精密量取馬錢子堿對照品適量，置于10 mL容量瓶中，用釋放介質溶解并定容，即得132.00 μg/mL的馬錢子堿對照品貯備液。

2.7.3? 標準曲線繪制

分別精密吸取馬錢子堿對照品貯備液，用釋放介質稀釋，配制成濃度分別為132.00、66.00、33.00、16.50、8.25、2.45 μg/mL系列馬錢子堿對照品溶液，按上述色譜條件進樣測定，以峰面積為縱坐標，對照品濃度為橫坐標繪制標準曲線，求得線性回歸方程：Y=37 195X-2813.7，r2=0.999。結果表明，馬錢子堿在2.45～132.00 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.7.4? 回收率試驗

在空白釋放介質中分別加入馬錢子堿對照品各3份，使其濃度分別為66.00、16.50、8.25 μg/mL，進樣測定，計算回收率。結果低、中、高濃度馬錢子堿平均回收率分別為98.22%、99.00%、98.50%，RSD分別為1.25%、1.45%、1.28%，符合含量測定要求[12]。

2.7.5? 精密度試驗

精密吸取馬錢子堿對照品貯備液10 ?L，于同一日內連續進樣6次，連續進樣6 d，測定峰面積，計算日內精密度及日間精密度。結果日內精密度RSD=1.30%，日間精密度RSD=1.73%，表明日內精密度及日間精密度均良好，符合含量測定要求[12]。

2.7.6? 穩定性試驗

精密吸取同一供試品溶液10 ?L，分別于0、2、4、8、10、12 h進樣，記錄峰面積，結果RSD=0.50%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.7.7? 重復性試驗

取同一批供試品6份，按“2.7.2”項下方法制成供試品溶液，進樣，記錄峰面積，結果RSD=0.90%，表明本方法重復性良好[13]。

2.8? 體外釋藥行為研究

2.8.1? 體外釋藥曲線繪制

采用動態膜透析法進行馬錢子堿NLC體外釋放研究。精密稱取馬錢子堿NLC凍干品（相當于馬錢子堿5 mg），用5 mL生理鹽水稀釋，確保使馬錢子堿NLC處于均勻混合狀態，轉入處理過的透析袋中，扎緊透析袋兩端，放入具塞錐形瓶中，精密量取50 mL釋放介質（含20%乙醇、pH 7.4的PBS），放入具塞錐形瓶中，調整透析袋位置，使透析袋完全浸沒在釋放介質中，放入恒溫水浴震蕩器中（溫度37.0 ℃±0.2 ℃，振搖速度100 r/min）。釋放開始后，分別于0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、6、8、10、12、18、24、36、48、60、72、84 h，用移液槍量取1 mL透析含藥外液，同時補充相同體積的透析空白外液，過0.22 μm微孔濾膜，取續濾液，按“2.7.1”項下色譜條件進樣測定，平行測定3次，計算馬錢子堿NLC的藥物累積釋放率。各時間點的藥物累積釋放率（Q）計算公式為：

式中，V0為釋放介質的總體積（mL），Ct為各時間點測得的藥物濃度（?g/mL），V為每次取樣體積，W為投入藥物總質量（mg）。

另精密稱取相同質量的馬錢子堿原料藥，按上述方法操作，進行體外釋藥研究。以累積釋放率對釋藥時間作圖，馬錢子堿原料藥與馬錢子堿NLC的藥物累積釋放曲線見圖3。

結果表明，在含20%乙醇pH 7.4的PBS釋放介質中，馬錢子堿原料藥釋藥相對較快，12 h馬錢子堿已基本全部釋放，累積釋放率為94.66%，而馬錢子堿NLC前4 h釋藥較快，累積釋放率為30.86%，之后釋藥曲線漸趨平穩，藥物緩慢釋放，48 h藥物基本釋放完全，72 h累積釋放率為86.74%。可見，將馬錢子堿制成NLC具有一定的緩釋效果。

2.8.2? 體外釋藥動力學擬合

采用零級動力學方程、一級動力學方程、Higuchi模型對馬錢子堿NLC的釋藥曲線進行擬合[14]，回歸方程見表1。R2越接近1，表明方程的擬合效果越好。結果顯示，馬錢子堿NLC體外釋放擬合最好的是Higuchi方程（R2=0.965 9），屬于典型的緩釋模型，表明馬錢子堿NLC具有一定的緩釋作用。

3? 討論

NLC進入體內后，其行為表現及藥效作用的發揮很大程度上取決于自身的制劑學性質，因此，制劑學性質考察是對NLC進行安全性、有效性、穩定性評估的基礎。本課題制備的馬錢子堿NLC呈完整的類球形實體粒子，粒子之間無明顯粘連，粒徑較小，Zeta電位測定結果顯示粒子表面帶負電，存在電子斥力，粒子間不會發生聚集，其絕對值較高，體系較穩定，可用于后續研究。

目前對納米粒釋藥機制的評價較單一，大多數情況采用模擬人體內部環境進行體外釋藥試驗研究，并據此推測藥物的體內釋放行為。鑒于馬錢子堿在PBS中的溶解度隨著乙醇含量增加而增加的特點，本研究釋放介質選擇含10%、20%、40%乙醇pH 7.4的PBS，及含0.1%吐溫-80、pH 7.4的PBS對馬錢子堿的穩定性進行考察，綜合考慮試驗結果，最終選擇20%乙醇pH 7.4的PBS作為馬錢子堿NLC的釋放介質。體外釋放試驗結果表明，將馬錢子堿NLC具有緩釋特性，其釋放規律符合Higuchi方程。馬錢子堿NLC前期有突釋現象，推斷為部分藥物聚集在外層;后期藥物釋放緩慢，可能為被包埋的藥物通過納米粒微孔擴散變得困難，藥物釋放主要取決于脂質的溶蝕。馬錢子堿NLC在體內以先快后慢的方式釋放藥物，先釋放的藥物可迅速起效，緩慢釋放的藥物可以持續作用，從而取得更好的治療效果。將馬錢子堿制備成納米制劑后通過靜脈注射給藥，可以避免口服給藥帶來的自身誘導代謝作用，提高靶向性。

藥物從NLC內釋放的實際過程很復雜，與諸多因素有關，除藥物在納米粒中所處的位置因素外，還涉及載體材料、表面電荷、粒子密度、藥物與粒子間的物理化學作用，以及釋藥環境等諸多因素[15-18]。盡管NLC體外釋藥情況與體內存在差別，但仍可在一定程度上反映體內釋藥情況，為預測馬錢子堿NLC體內釋藥情況提供依據，指導其處方設計和制備工藝的改進。

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（收稿日期：2018-09-20）

（修回日期：2018-10-16;編輯：陳靜）