食品中“新型瘦肉精”的檢測方法研究進展

曹金博 王耀 李燕虹

摘要對苯乙醇胺A、賽庚啶、可樂定、巴氯芬等常見“新型瘦肉精”藥物的檢測方法進行綜述，主要有高效液相色譜法、氣相色譜-質譜法、毛細管電泳法等儀器檢測方法以及酶聯免疫法、免疫層析法、電化學發光免疫法等免疫分析方法，為保障我國動物性食品安全提供更好的技術支撐。

關鍵詞新型瘦肉精；危害；檢測方法

中圖分類號TS207.3文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）08-0001-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.001

AbstractThe detection methods of common “new type lean meat” drugs such as phenylethanolamine A，cyheptadine，clonidine and baclofen were summarized，the main detection methods include highperformance liquid chromatography，gas chromatographymass spectrometry，capillary electrophoresis and other instrumentation methods，and immunoassay methods such as enzymelinked immunoassay，immunochromatography，and electrochemiluminescence immunoassay，so as to provide better technical support for ensuring the safety of animal food in China.

Key wordsNew type lean meat powder；Harm；Detection method

瘦肉精是一類國家禁止在禽畜養殖中使用的腎上腺素受體激動劑類藥物的俗稱，將其添加在飼料或動物飲水中能有效促進禽畜生長，提高瘦肉率[1]。傳統的瘦肉精藥物一般包括鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇等，是目前禽畜養殖中主要監控的藥物[2-3]，但近些年，隨著我國食品安全監管力度的加大，一些不法分子為逃避監控開始使用一些功能類似的“新型瘦肉精”藥物，如苯乙醇胺A、賽庚啶、可樂定、巴氯芬等[4]。農業部在2010年發布1519號公告，明確規定禁止在飼料和動物飲水中添加苯乙醇胺A等物質。因此，為加強動物性食品安全監控，開展“新型瘦肉精”檢測方法研究尤為必要。

1概述

“新型瘦肉精”的出現給動物性食品安全檢測帶來新的挑戰，尤其針對苯乙醇胺A、賽庚啶、可樂定、巴氯芬等藥物的檢測[5]，其結構式如圖1所示，此類藥物雖結構式各不相同，但卻共同具有促生長、提高瘦肉率的作用[6-8]。研究表明，“新型瘦肉精”類藥物主要通過以下兩個途徑對動物體內營養素進行再分配。一是與細胞膜上的受體結合，激活G蛋白釋放二磷酸鳥苷（GDP），GDP與三磷酸鳥苷（GTP）結合從而活化腺苷酸活化酶（AC），進而促進環-磷酸腺苷（cAMP）水平升高[9]。cAMP可對多種酶和細胞代謝進行調節，一方面活化甘油三酯酶，提高血漿脂肪酸含量，使游離脂肪酸進入肌肉組織中加強氧化作用[10]；另一方面使糖原合成酶失活，促進糖原分解，進而加快脂肪分解和蛋白質合成；二是降低脂肪細胞膜上胰島素受體數量，使葡萄糖進入脂肪細胞的數量減少，從而降低脂肪沉積[11]。

“新型瘦肉精”類藥物容易在機體內蓄積，一次性大量攝入或長期攝入將會引起機體急性中毒或慢性中毒，從而導致機體系統紊亂，嚴重影響身體健康。大量研究表明，苯乙醇胺A具有呼吸毒性、心血管毒性以及神經毒性，其中毒癥狀主要表現為頭暈、無力、顫抖、心悸等，尤其對高血壓患者和心臟病患者來說，其中毒癥狀更為嚴重[12]；賽庚啶在體內濃度過高會引起疲勞、嗜睡、內分泌失調、抽搐等癥狀[13]；可樂定中毒表現為口干舌燥、心動緩慢等[14-15]；而巴氯芬則會引起惡心、頭疼、嘔吐、腹瀉甚至抑郁等中毒癥狀[16]。

2主要檢測方法

目前，“新型瘦肉精”的檢測方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜-質譜法、毛細管電泳法等儀器檢測方法以及酶聯免疫法、免疫層析法、電化學發光免疫法等免疫分析方法。

2.1高效液相色譜法

高效液相色譜法根據樣品中各成分極性不同，在色譜柱內將其分離，分別進入檢測器中進行檢測，從而實現對樣品的分析[17]。Kountourellis等[18]采用高效液相色譜法檢測尿液中鹽酸賽庚啶含量，總回收率為76.16%，檢測線為15 ng/mL，操作簡單，靈敏度高、結果可靠。吳荷琴等[19]建立一種高效液相色譜法用于檢測動物性食品中鹽酸賽庚啶，檢測線為0.019～0.022 mg/kg，回收率為98%～100%，重復性RSD為5.5%（n=6），該方法靈敏度高，重復性好，能準確檢測出動物性食品中鹽酸賽庚啶藥物殘留。樊宇飛等[20]在高液相色譜法基礎上引入二極管陣列檢測器（PDA），在對飼料中苯乙醇胺A的檢測中，檢測線為0.06 mg/kg，回收率高于90.36%，變異系數低于5.98%，該法通過對檢測部件和條件的優化，極大地降低了檢測限，提高了方法的靈敏度，從而可迅速、準確檢測出飼料中苯乙醇胺A藥物殘留。

在高效液相色譜法基礎上發展起來的液相色譜-串聯質譜法兼具色譜技術高效的快速分離能力以及質譜技術超高的靈敏度，可在多種物質共同存在條件下對特定物質進行定性和定量分析，且能夠實現超痕量物質的最低檢測。Feás等[21]建立了一種快速檢測藥物樣品中鹽酸賽庚啶的液相色譜-串聯質譜法，檢測限為0.86 ng/mL，定量限為0.98 ng/mL，可用于7種不同藥物制劑中鹽酸賽庚啶檢測分析。Mendes等[22]采用高效液相色譜-串聯質譜法測定人血漿中鹽酸賽庚啶含量，將檢測限降低為0.05 ng/mL，檢測靈敏度大大提高。許秀琴等[23]同樣采用高效液相色譜串聯質譜法測定豬毛中鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶，其檢測限均為0.2 μg/kg，相對標準偏差（RSD）小于10%，該方法檢測限較低，但回收率范圍偏寬，為85%～110%。吳劍平等[24]在基礎方法上建立一種超高液相色譜-串聯質譜法來檢測豬尿中鹽酸賽庚啶藥物殘留，檢測限為0.05 μg/kg，回收率范圍為90.2%～109.7%，相比于液相色譜-串聯質譜法，該方法檢測限更低，回收率范圍有所減小，且具有更高的準確度和精密度。

2.2氣相色譜-質譜法

氣相色譜-質譜法是氣相色譜分離組分后，質譜再對各組分進行定性、定量分析的一種檢測方法。氣相色譜分離效率高，分離能力強，而質譜技術在鑒定化合物方面非常準確，兩種技術結合起來使得檢測效率以及精確度更高，且可控性強，操作方便。楊正慧[25]采用氣相色譜-質譜法對食品中苯乙醇胺A進行檢測，檢測限為3.8 ng/mL，但當苯乙醇胺A濃度過低時，存在離子碎片相對豐度不穩定的現象，影響試驗結果。Ye等[26]采用直接浸入式固相微萃取技術與氣相色譜-質譜法連用來檢測豬肉中的鹽酸賽庚啶，檢測限為3.6 ng/g，回收率為97.4%～105.7%，與傳統的方法相比，該方法檢測限低、回收率范圍小、成本低、檢測速度快，且已經成功應用于市場上豬肉樣品的分析與檢測。

2.3毛細管電泳法

毛細管電泳法根據樣品中各成分之間的淌度以及分配能力，以高壓電場作為驅動力，以毛細管作為分離通道，從而實現對樣品的分離和分析鑒定。該方法柱效高，分離速度快，選擇性強，樣品和試劑消耗少。李志業等[27]建立高效毛細管電泳法測定鹽酸賽庚啶片中鹽酸賽庚啶含量。該方法采用熔融石英毛細管柱，醋酸鹽作為運行緩沖液，其檢測限為0.002 g/L，最低定量限為0.007 g/L，該方法重復性較好且操作簡便。曹麗偉等[28]通過毛細管電泳法結合激光誘導熒光技術建立一種新的聯合檢測方法來檢測血清中的巴氯芬含量，檢測限為6×10-10mol/L，回收率為95.8%～101.0%，該方法引入熒光素進行標記，使得靈敏度和檢測效率大大高。

2.4酶聯免疫法

酶聯免疫法（Enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）是一種可以進行定性和定量分析的免疫分析方法，在食品安全檢測領域占有非常重要的地位[29-30]。利用ELISA方法對小分子危害物進行檢測時多采用其間接競爭模式，如圖2所示，它利用抗原對抗體的特異性結合能力以及酶對底物的催化顯色作用，最后根據顏色反應深淺和酶標儀所測吸光度值來進行定量或定性分析，操作簡單、靈敏度高、成本低廉且不需要專業的操作人員以及昂貴的儀器設備，可實現現場大批量樣品的快速檢測[31]，目前在一些“新型瘦肉精”藥物的快速檢測中已經初步用到了此項技術。Wang等[32]研發了一種間接競爭ELISA試劑盒用于檢測豬肉樣品中苯乙醇胺A殘留，該試劑盒檢測限低于0.008 μg/kg，半數抑制濃度（IC50）為0.32 ng/mL，已成功應用于屠宰后禽畜肉樣的檢測。顧文龍等[33]采用ELISA方法測定了豬尿中賽庚啶殘留，檢測限為169 ng/L，回收率為85.7%～95.4%，相對標準偏差為0.87%～3.54%，該方法重復性好，回收率高。萬宇平等[34]同樣采用ELISA方法測定了動物組織中賽庚啶殘留，IC50為0.23 μg/L，檢測限為0.3 μg/L，但回收率范圍偏寬，為85.1%～114.5%。黃士新等[35]基于單克隆抗體建立一種測定動物尿液中賽庚啶留量的間接ELISA檢測試劑盒，該試劑盒檢測限為0.158 μg/L，IC50為0.316 μg/L，回收率在80%～110%，該試劑盒不但操作簡便，而且能夠完成多個樣品的同時檢測。

2.5膠體金免疫層析法

膠體金免疫層析法是基于抗原抗體的特異性結合和膠體金標記技術建立的一種快速免疫分析檢測方法[36]。膠體金免疫層析試紙主要由樣品墊、膠體金結合墊、檢測線、質控線、吸水墊等組成，其結構如圖3所示。在對樣品進行檢測時，可根據層析膜上檢測線和質控線呈現的特征顏色判定結果。與ELISA相比，該方法敏度高，對操作人員要求低，且不需要昂貴的儀器設備，而且可實現多殘留檢測[37]。聶雯瑩等[38]基于單克隆抗體研制了快速檢測苯乙醇胺A殘留的膠體金免疫層試紙，試紙檢測限為5 μg/L，假陽性率和假陰性率均為0，且在對動物尿樣進行檢測時，檢測結果和ELISA測定結果沒有差異，但回收率范圍偏大，為75%～105%。Dai等[39]同樣利用單克隆抗體研制了一種膠體金免疫層析試紙，在對豬尿中的苯乙醇胺A進行檢測時，該試紙的IC50為0.52 ng/mL，檢測限為0.188 ng/mL，定量限為0.263 ng/mL，該試紙在特異性和靈敏度方面均有所提高。李明心[40]結合表面增強拉曼光譜和膠體金免疫層析技術研發了一種新型的免疫層析試紙，在對動物組織尿液中苯乙醇胺A進行檢測時，IC50為0.06 ng/mL，檢測限為0.32 pg/mL，相對于其他免疫分析方法，靈敏度提高了1～3個數量級。

2.6電化學發光免疫法

電化學發光免疫法運用了免疫分析方法和電化學發光檢測技術[36]。它與酶聯免疫吸附實驗的不同之處在于將電化學發光反應試劑標記在抗原或抗體上，通過與待檢靶標物質發生免疫反應所產生的前后電化學發光信號的變化，并借助相關儀器放大顯示出來，以此來實現靈敏特異檢測。該方法無放射性污染，操作簡單，特異性強，靈敏度高[41]。與酶聯免疫吸附實驗相比，其靈敏度有所提高，與膠體金免疫層析法相比，其結果表現更加直觀，目前，已經廣泛應用于臨床診斷、環境監測、藥物分析等領域[42]。濟南大學張勇等[43]研發了一種無標記電化學發光免疫傳感器，在對動物性食品中苯乙醇胺A殘留進行檢測時，回收率為93.5%～105%，結果相對偏差（RSD）小于3.3%，靈敏度高、特異性強、結果準確。湯慶會[44]以L-半胱氨酸為穩定劑，在水相中合成CdSe量子點，所構建的電化學發光免疫傳感器對樣品中苯乙醇胺A殘留進行檢測時，檢測線為0.015 ng/mL，線性相關系數為0.997 6，原理如圖4所示。而閆盼盼[45]則以巰基乙酸為穩定劑，所構建的電化學發光免疫傳感器同樣對食品中的苯乙醇胺A殘留進行檢測時，最低檢測限為0.008 4 ng/mL，相比湯慶會等所構建的方法檢測限降低了一半，并且具有更好的穩定性和重現性。

3小結與展望

“新型瘦肉精”的出現以及在禽畜養殖中的違規濫用，導致其在動物源性食品中大量的殘留，嚴重威脅人體健康，因此，相關監管部門必須加大對此類藥物的監管力度。同時為提高檢測效率以及檢測的精準度，建立快速、靈敏、特異的“新型瘦肉精”檢測方法尤為必要。目前，高效液相色譜法、氣相色譜-質譜法等儀器檢測方法已經成熟應用于“新型瘦肉精”殘留檢測，且因其選擇性強、分辨率高、假陽性低等優點而被廣泛應用，但存在儀器昂貴、樣品前處理復雜、不適合大批量現場篩查等局限，已不能滿足實際現場監控的需要。相比之下，免疫分析方法利用高親和力抗體對抗原進行特異性識別，靈敏度高、特異性強且可實現現場篩選和大批量樣品快速分析檢測。但免疫分析方法容易出現假陰性與假陽性結果，因此在特異性抗體的制備方面還需進一步優化和完善。隨著免疫分析方法的發展，現已形成包括酶聯免疫分析、膠體金免疫分析、化學發光免疫分析、熒光免疫分析、放射免疫分析等在內的免疫分析體系，而今后針對“新型瘦肉精”免疫分析方法的研究也將不斷深入，為我國動物性食品安全提供更好的技術支撐。

參考文獻

[1] 張改平，王選年，肖肖.瘦肉精的毒害作用及其試紙快速檢測技術[J].中國動物檢疫，2011，28（5）：1-6.

[2] BI S Y，PANG B，WANG T J，et al.Investigation on the interactions of clenbuterol to bovine serum albumin and lysozyme by molecular fluorescence technique[J].Spectrochimica acta part A：Molecular & biomolecular spectroscopy，2014，120（24）：456-461.

[3] YANG J W，WANG Z N，ZHOU T，et al.Determination of cyproheptadine in feeds using molecularly imprinted solidphase extraction coupled with HPLC[J].Journal of chromatography B，2015，990：39-44.

[4] KONISHI H，IGA I，NAGAI K.Underestimation of rat serum vancomycin concentrations measured by an enzymemultiplied immunoassay technique and the strategy for its avoidance[J].Drug testing & analysis，2014，6（4）：350-356.

[5] CHEN D，YANG M，ZHENG N J，et al.A novel aptasensor for electrochemical detection of ractopamine，clenbuterol，salbutamol，phenylethanolamine and procaterol[J].Biosensors & bioelectronics，2016，80：525-531.

[6] PAPICH M G.Cyproheptadine hydrochloride[M]//PAPICH M G.Saunders handbook of veterinary drugs.4th ed.St.Louis：W.B.Saunders，2016：197-198.

[7] FIELDING S，LAL H.Clonidine：New research in psychotropic drug pharmacology[J].Medicinal research reviews，1981，1（1）：97-123.

[8] HEETLA H W，STAAL M J，PROOST J H，et al.Clinical relevance of pharmacological and physiological data in intrathecal baclofen therapy[J].Archives of physical medicine & rehabilitation，2014，95（11）：2199-2206.

[9] 劉佳.β-受體激動劑在肉牛體內代謝及殘留規律研究[D].蘭州：蘭州大學，2017.

[10] 莊宏，楊紅建，曹兵海.鹽酸克倫特羅在牛體不同組織中的代謝和殘留分析綜述[J].中國農業大學學報，2010，15（2）：35-39.

[11] 湯超華，張軍民，李勵軍.萊克多巴胺在反芻動物體內代謝及殘留規律研究進展[C]//中國毒理學會獸醫毒理學與飼料毒理學學術討論會暨獸醫毒理專業委員會第4次全國代表大會會議論文集.北京：中國毒理學會，2012.

[12] MIYAZAKI T，NAKATA K，NISHIMURA T，et al.Identification of 2phenylethanol with a roselike odor from anal sac secretions of the small Indian mongoose（Herpestes auropunctatus）[J].Biosci Biotechnol Biochem，2018，82（2）：232-237.

[13] VON MHLENDAHL K E，KRIENKE E G.Toxicity of cyproheptadine.Side effects and accidental overdosage[J].Monatsschrift fur kinderheilkunde，1978，126（3）：123-126.

[14] 王漢斌，熊錫山，孫成文，等.北京懷柔“4.23”急性可樂定中毒事件臨床救治體會[J].中國科學：生命科學，2011，41（10）：1043-1047.

[15] SEGER D L.Clonidine toxicity revisited[J].Journal of toxicology clinical toxicology，2002，40（2）：145-155.

[16] 王霞，康海燕.中樞性肌松劑巴氯芬臨床應用及不良反應[J].臨床醫學，2011，31（2）：114-115.

[17] WALDRON K W，PARR A J，NG A，et al.Cell wall esterified phenolic dimers：Identification and quantification by reverse phase high performance liquid chromatography and diode array detection[J].Phytochem Anal，1996，7（6）：305-312.

[18] KOUNTOURELLIS J E，OBETE K O.Reversedphase high performance liquid chronatographic determination of cyproheptadine from urine by solidphase extraction[J].J Chronatogr B，1995，664（2）：468-471.

[19] 吳荷琴，陳朝霞.高效液相色譜法測定鹽酸賽庚啶的有關物質[J].藥學實踐雜志，2017，35（1）：60-63，69.

[20] 樊宇飛，蘇曉鷗，劉萌.超高效液相色譜測定豬配合飼料中苯乙醇胺A的研究[J].中國畜牧獸醫，2013，40（5）：225-228.

[21] FES X，YE L，HOSSEINI S V，et al.Molecularly imprinted polyallylamine hydrogels：Another reassessment[J].Polymer international，2010，59（1）：11-15.

[22] MENDES G D，ARRUDA A，CHEN L S，et al.Quantification of cyproheptadine in human plasma by highperformance liquid chromatography coupled to electrospray tandem mass spectrometry in a bioequivalence study[J].Biomedical chromatography：BMC，2015，26（1）：129-136.

[23] 許秀琴，楊挺，趙健，等.高效液相色譜-串聯質譜法測定豬毛中鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶[J].中國獸藥雜志，2015，49（7）：47-51.

[24] 吳劍平，張鑫，顧欣，等.分散液相微萃取/超高效液相色譜-串聯質譜法檢測豬尿中鹽酸賽庚啶殘留量的研究[J].分析測試學報，2013，32（7）：834-839.

[25] 楊正慧.氣相色譜-質譜法檢測β-受體激動劑殘留量的方法研究[D].長春：吉林大學，2012.

[26] YE D R，WU S S，XU J Q，et al.Rapid determination of clenbuterol in pork by direct immersion solidphase microextraction coupled with gas chromatographymass spectrometry[J].Journal of chromatographic science，2016，54（2）：112-118.

[27] 李志業，張軍.高效毛細管電泳法測定鹽酸賽庚啶的含量[J].鄭州大學學報（醫學版），2009，44（4）：849-850.

[28] 曹麗偉，胡楊.毛細管電泳分離-激光誘導熒光檢測血清中的巴氯芬[J].光譜實驗室，2011，28（4）：1659-1662.

[29] QU X L，LIN H，DU S Y，et al.Development of a nanogold capillary immunochromatographic assay for rapid and semiquantitative detection of Clenbuterol residues[J].Food analytical methods，2016，9（9）：2531-2540.

[30] LI Z Z，WANG Y，LI D M，et al.Development of an indirect competitive enzymelinked immunosorbent assay for screening ethopabate residue in chicken muscle and liver[J].RSC Advance，2017，7：36072-36080.

[31] LIU Z，ZHI A M，ZHAO L N，et al.Development of an ELISA for detection of Sudan I in food samples using monoclonal antibody[J].Food and agricultural immunology，2014，25（4）：556-568.

[32] WANG X M，LIUFU T L，BELOGLAZOVA N V，et al.Development of a competitive indirect enzymelinked immunosorbent assay for screening phenylethanolamine A residues in pork samples[J].Food analytical methods，2016，9（11）：3099-3106.

[33] 顧文龍，王靜，端禮欽，等.酶聯免疫法檢測豬尿中賽庚啶[J].黑龍江畜牧獸醫，2013（23）：80-81.

[34] 萬宇平，羅曉琴，郝小妹，等.動物組織中賽庚啶競爭酶聯免疫法的建立[J].中國釀造，2014，33（10）：130-132.

[35] 黃士新，李丹妮，顧欣，等.賽庚啶ELISA檢測試劑盒的研制及其性能評價[J].中國獸藥雜志，2016，52（11）：44-48.

[36] DZANTIEV B B，BYZOVA N A，URUSOV A E，et al.Immunochromatographic methods in food analysis [J].TrAC Trends in Analytical Chemistry，2014，55（55）：81-93.

[37] ZHANG G P，WANG X N，YANG J F，et al.Development of an immunochromatographic lateral flow test strip for detection of βadrenergic agonist Clenbuterol residues[J].Journal of immunological methods，2006，312（1/2）：27-33.

[38] 聶雯瑩，羅曉琴，李金超，等.動物尿液中苯乙醇胺A膠體金快速檢測方法的建立[J].中國農業科學，2015，48（19）：3931-3940.

[39] DAI M Y，GONG Y F，LIU A M，et al.Development of a colloidal goldbased lateralflow immunoassay for the rapid detection of phenylethanolamine A in swine urine[J].Analytical methods，2015，7（10）：4130-4137.

[40] 李明心.基于貴金屬納米顆粒的表面増強拉曼散射免疫層析分析方法的研究[D].蘇州：蘇州大學，2015.

[41] 付志鋒，魏偉，李翠芳，等.電化學發光免疫傳感技術在生物藥物分析中的研究進展[J].中國科學：化學，2011，41（5）：773-784.

[42] WANG H J，YUAN R，CHAI Y Q，et al.An ultrasensitive peroxydisulfate electrochemiluminescence immunosensor for Streptococcus suis serotype 2 based on lcysteine combined with mimicking bienzyme synergetic catalysis to in situ generate coreactant[J].Biosensors & bioelectronics，2013，43（15）：63-68.

[43] 張勇，馬洪敏，魏琴，等.無標記電致化學發光瘦肉精免疫傳感器的制備方法和應用：CN104502429A[P].2015-04-08.

[44] 湯慶會.低毒性量子點和CdSe@SiO2的合成及用于電化學發光免疫檢測小分子物質[D].蘇州：蘇州大學，2015.

[45] 閆盼盼.基于量子點和膠體金電化學發光免疫傳感器的構建及應用[D].蘇州：蘇州大學，2014.