茶葉中主要化學成分的質譜分析

李東芹 佘廣彪

摘要 [目的]建立茶葉中茶多酚、生物堿及茶氨酸的質譜分析方法。[方法]采用Shim-pack VP-ODS（150 L×2.0 mm，5 μm）色譜柱，甲醇、水梯度洗脫20 min進行色譜分離；在質譜正離子模式下，用多反應監測離子對（MRM）模式進行定量分析。[結果]可在20 min內同時定量9種茶多酚、生物堿和茶氨酸。[結論]該方法靈敏、準確、選擇性高，適應于茶葉中茶多酚、生物堿和茶氨酸的快速定量分析。

關鍵詞 茶葉；茶多酚；生物堿；茶氨酸；液相色譜-串聯質譜

中圖分類號 TS207.3 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）08-0195-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.051

Abstract [Objective]The research aimed to establish a mass spectrometric analysis method for tea polyphenols，alkaloids and theanine in tea.[Method]The column was separated by a Shimpack VPODS （150 L×2.0 mm，5 μm） column and eluted with methanol and water for 20 min.[Result]Quantitative analysis was performed using the multiple reactions monitoring （MRM） mode in mass spectrometry positive ion mode.[Result]The method could quantitate 9 kinds of theanine，tea polyphenols and Alkaloids in 20 min.[Conclusion]The method is rapid，accurate and selective，it can be used to quantitate theanine，tea polyphenols and alkaloids rapidly in tea.

Key words Tea；Tea polyphenols；Alkaloids；Theanine；Liquid chromatographytandem mass spectrometry

茶葉中含有非常豐富的營養成分和藥效成分，是人們日常生活中最常飲用的“健康飲料”。 茶葉中含有300多種對人體有益的化學成分，包括氨基酸、茶多酚、生物堿、維生素等[1]。茶葉中氨基酸的主要成分為茶氨酸和谷氨酸；茶葉藥效功能的主要成分為茶多酚，約占茶葉干重的18%～36%，而茶多酚又以兒茶素類為主[2]。兒茶素類主要組成成分為表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）。茶多酚具有抗氧化、抗血栓、抑制細菌、提高人體免疫力等功效[3]，已有的科學研究證明茶多酚對老年癡呆、糖尿病和乳腺癌具有防治和抑制作用[4-6]。前人的研究主要集中在液相色譜分析方法[7-9]或者某一類化合物的研究[10-13]，液相色譜-串聯質譜分析方法應用的比較少[14-15]。筆者利用液相色譜質譜高靈敏、高選擇性的分析特點，建立同時定量茶葉中主要化學成分的分析方法，可為茶葉品質分析或藥用價值開發提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試材。安吉白茶、鐵觀音和紫娟茶葉鮮樣于2017年5月采自安徽農業大學郭河品種茶園，采摘部位為一芽二葉。華農綠針為華中農業大學生產的商業成品綠茶；貢品大紅袍為福建省武夷山市慧苑巖茶科學技術研究所研制的半發酵烏龍茶，市面采購；松峰茶為湖北省赤壁市羊樓洞茶葉有限公司生產的綠茶，市面采購。

1.1.2 儀器。

日本島津LC-20AD 液相色譜儀，島津Shim-pack VP-ODS（150 L×2.0 mm，5 μm）色譜柱；美國AB Sciex 公司API 4000 Qtrap 串聯三重四級桿線性離子阱質譜儀；Millipore 超純水儀（Millipore公司）；萬分之一天平（梅特勒公司）；蠕動泵（Hamilton公司）。

1.1.3 試劑。乙腈（Merk，色譜純）；超純水；乙酸（色譜純）；1 mL 醫用注射器；0.22 μm過濾頭（有機相，津騰牌）；谷氨酰胺、谷氨酸、茶氨酸、表兒茶素（EC）、沒食子兒茶素（EGC）、兒茶素沒食子酸酯（ECG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、可可堿及咖啡堿均為西格瑪公司色譜純試劑，由安徽農業大學茶食學院趙劍教授提供。

1.2 樣品處理方法

1.2.1 茶葉鮮樣。精確稱取0.035 g茶葉鮮樣干粉，加5 mL 80%的甲醇水溶液，冰浴超聲提取30 min，然后離心取上清，經 0.22 μm濾膜過濾，稀釋100倍后進樣分析。

1.2.2 商品茶葉。精確稱取0.15 g商品茶葉，加50 mL沸水浸泡40 min，然后離心取上清，經 0.22 μm濾膜過濾，稀釋10倍后進樣分析。

1.3 試驗條件

1.3.1 色譜條件。島津Shim-pack VP-ODS（150 L×2.0 mm，5 μm）色譜柱，樣品室溫度為室溫；流動相：A為0.1%的乙酸水溶液（V/V），B為0.1%的乙酸的甲醇溶液（V/V）；流速為0.25 mL/min。梯度洗脫條件為：0～4.0 min，10%的B；4.1～10.0 min B從10%升至100%，10.0～15 min為100%的B，15.01～20.00 min為10%的B。柱溫箱溫度為40 ℃，進樣量為10 μL。

1.3.2 質譜條件。采用電噴霧（ESI）離子源，在正離子電離模式下選用多反應監測（MRM）離子對掃描模式進行定量分析。電噴霧電壓5 500 V；離子源溫度500 ℃；離子源輔助氣GS1/GS2氣流均為50 L/h。

2 結果與分析

2.1 化合物質譜參數優化 將各化合物標準品用甲醇水配制成100 μg/L左右的溶液。用針泵注射器以10 μL/min的速度直接進到質譜儀。先用質譜Q1全掃描模式，在分子量100～500 Da掃描確定化合物的Q1母離子，同樣電壓下比較正負離子模式下母離子的強度，確定正離子電離模式信號較高，然后再優化DP電壓。再在子離子掃描模式下，對Q1母離子進行打碎，優化碎裂能量（CE），使各子離子碎片和母離子信號強度比例最優。從化合物的二級質譜碎片中（圖1），選取信號強度最高的子離子作為Q3，與母離子Q1組成定量分析的特征離子對MRM進行定量分析，各化合物MRM離子對參數及選擇離子流色譜圖見圖2和表1。

2.2 標準曲線方程和檢出限

分別稱取各化合物標準品2.5 mg，用80%甲醇/水（V/V）定容為100 mL的混合母液。 繼續用水溶液稀釋成250、125、62.5、31.25、15.6 μg/L的梯度標準溶液。在“1.3”試驗條件下上機分析，以各化合物的濃度為橫坐標x、相應峰面積為y繪制標準曲線，得到各物質的標準曲線方程（表1）。

2.3 回收率試驗

因茶葉樣品中的兒茶素在熱水浸提過程中有相互轉化，因此做加標回收試驗沒有太大的意義[10]。

2.4 茶葉樣品定量分析 將安吉白茶、鐵觀音和紫仙3種茶葉鮮樣粉末分別稱取2份，按“1.2.1”方法處理后上機分析，得到各化合物含量見表2。分別稱取市售商品茶葉華農綠針、貢品大紅袍、松峰茶2份，按“1.2.2”方法處理后上機分析，得到各化合物含量見表3。

從表2可看出，同一品種茶葉中各化合物含量有顯著差異；不同茶葉品種之間各化合物含量差別比較大，基本規律是EGCG含量最高，ECG或茶氨酸其次。從表3和表2數據對比發現，商品茶中各化合物的含量除了可可堿都遠低于新鮮茶葉，應該是商品茶不同配方和加工過程中損失造成的。無論是新鮮茶葉還是商品茶葉，都未檢測到茶葉堿，可能是因為本身含量太低及前處理損失導致未能檢出。

3 結論與討論

該研究建立的多種茶多酚、茶氨酸和生物堿的質譜檢測方法，可在20 min內定量出茶葉中9種主要化合物的含量。該方法與常用的高效液相色譜方法相比，靈敏度和選擇性有顯著提高；質譜檢測的高選擇性有效降低了基質干擾，提高了測定結果的準確度；每個化合物MRM離子對都有單獨的檢測通道，即使2種化合物保留時間完全一樣也不會影響其峰面積定量。該方法可適用于茶葉研究中茶多酚、生物堿和茶氨酸的快速定量分析。 參考文獻

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