黃連大黃肉桂復方及其有效組分配伍對人肝癌細胞株SMMC-7721端粒酶的影響*

磨 煉 楊林浩 嚴 格 劉小美

上海中醫藥大學中西醫臨床醫學院 (上海， 201203)

中醫藥是肝癌綜合防治體系的重要組成部分。課題組前期已發現黃連大黃肉桂復方及其有效組分配伍(小檗堿、大黃素和桂皮醛)可有效抑制肝癌細胞的增殖[1]。結合端粒酶與腫瘤發生和異常增殖密切相關和端粒酶逆轉錄酶( hTERT)在維持端粒酶活性中起關鍵限速作用等報道[2]，本研究擬探討復方及其組分配伍對肝癌細胞中hTERT的mRNA和蛋白表達的影響，探索其抑制肝癌細胞增殖的可能機制。其研究結果將為該復方及其組分配伍開發成為有效地抗肝癌新藥提供部分實驗數據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞株 SMMC-7721人肝癌細胞株，購自中國科學院上海細胞研究所。

1.2 主要試劑與藥品 黃連大黃肉桂復方由中藥飲片黃連、大黃和肉桂組成(黃連∶大黃∶肉桂為9∶3∶1)，均購自上海養和堂張江店。RPMI 1640培養液、胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液(100×)和0.25%胰酶，均購自美國Hyclone 公司；小檗堿、大黃素購自中國食品藥品檢定研究院，桂皮醛購自美Sigma-Aldrich公司；二甲基亞砜(DMSO)，購自美國Sigma公司；TRIzol，購自美國 Invitrogen公司；PrimeScript RT reagent Kit和SYBR Premix Ex Taq，購自日本Takara公司；Protein Ladder、BCA蛋白質定量檢測試劑盒、RIPA裂解液、PMSF、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、BeyoECL PLUS購自碧云天(上海)生物技術有限公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；PCR擴增引物由賽默飛公司合成； 兔抗GADPH和hTERT與辣根過氧化酶標記的二抗均購自美國Abcam公司。

1.3 儀器 CKX41熒光倒置相差顯微鏡為日本Olympus公司產品；ELX-800全自動酶標儀，美國Bio-TEK公司生產；NanoDrop 2000/2000c 紫外-可見分光光度計，美國賽默飛公司生產；Eco PCR儀器，美國Illumin公司生產；Universal Hood II化學發光成像分析系統，美國Biorad公司生產。

1.4 細胞培養 常規復蘇SMMC-7721人肝癌細胞，培養在加有10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養基中，置于37℃恒溫且充有5%CO2和95%空氣混合氣體的培養箱中，每2～3天更換培養液1次。

1.5 藥物配制及用藥 復方配制方法同課題組以往發表文獻[1]；小檗堿以無菌Mini-Q水配制母液濃度為5mM(80℃水浴中助溶10min)；大黃素和桂皮醛分別以DMSO配制成40mM和50mM的母液；以上藥液用之前以培養液稀釋至目標濃度，即復方為0.86mg/ml，小檗堿、大黃素和桂皮醛分別為44μM、23μM和46μM(即組分配伍)。用藥：取對數生長細胞常規消化細胞并計數后按2×105/孔接種至6孔板中，設3個組別，分別是對照組、復方組和組分組，每組做3個復孔。3組分別給予0.1%DMSO、0.86mg/mL黃連大黃肉桂復方以及組分配伍。以上藥物作用24h后在倒置顯微鏡下觀察細胞數量和形態并拍照，然后收集細胞用于提取總RNA和蛋白質。

1.6 檢測hTERT mRNA表達 以TRIzol一步法提取各組細胞總RNA，并檢測總RNA的濃度和質量。以RT試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，并利用SYBR green實時熒光定量PCR試劑盒擴增cDNA中的hTERT，同步擴增內參GAPDH。擴增基因的引物序列如下：GAPDH(Forward：5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′，Reverse：5′-GATCTCGCTCCTGGAAGATG-3′)；hTERT(Forward：5′-GTGACCGTGGTTTCTGTGTG-3′，Reverse：5′- CCTTGTCGCCTGAGGAGTAG -3′)。擴增條件為95℃ 30 sec；95℃ 30 sec，60℃ 30 sec，40個循環。結果采用相對定量法(2-△△CT法)對目的基因進行分析，計算各組hTERT的相對表達量。

1.7 Western Blot檢測hTERT蛋白表達 以RIPA裂解細胞，離心收集上清液以BCA法測定其蛋白濃度。取12μg蛋白變性后電泳，轉膜、封閉后，加入一抗(hTERT和GAPDH均以1∶1000稀釋)后放于4℃冰柜搖床輕搖孵育過夜。TBST清洗3次后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(抗兔IgG 1∶1000)室溫孵育1h，TBST清洗3次。ECL顯色曝光獲得圖像，使用Image J軟件分析圖像并計算各用藥組目的蛋白的相對表達量。

1.8 統計學方法 采用SPSS 25.0軟件，計量資料以平均值±標準差表示，多組比較采用單因素方差分析，檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組人肝癌細胞SMMC-7721形態變化 與對照組比較，復方組細胞24h后其細胞附壁邊界不清、消失，細胞浮起變圓，甚至萎縮、變暗、漂浮死亡，細胞間隙增大，胞質內可觀察到高折光性顆粒增多，細胞間融合部分斷裂，偶見區域性脫落。懸浮死亡的細胞為組分組>復方組>對照組，即藥物對肝癌細胞的增殖具有一定的抑制作用。見插頁圖1。

2.2 黃連大黃肉桂復方及組分配伍對肝癌細胞hTERT mRNA表達的影響 與對照組比較，復方組和組分組hTERT mRNA的表達均有不同程度的上調，但無統計學差異(P>0.05)，其中復方組上調幅度大于組分組。見圖2。

圖2 各組hTERT mRNA表達圖

2.3 黃連大黃肉桂復方及組分配伍對肝癌細胞hTERT 蛋白表達的影響 與對照組比較，復方組和組分組hTERT 蛋白表達均下降，其中又以組分組為甚，但無統計學差異(P>0.05)。見圖3、圖4。

圖3 3組細胞hTERT 蛋白表達凝膠曝光圖

圖4 3組細胞hTERT 蛋白表達圖

3 討論

肝癌是我國常見惡性腫瘤之一，對人類健康危害極大。通過現代醫學手段如化療、射頻消融、生物治療等治療肝癌，均會產生不同程度的毒副作用[4～6]，嚴重影響患者生活質量。與此同時，祖國傳統醫學在肝癌不同階段、針對不同個體實行辨證論治的方法，在改善患者臨床癥狀、減輕放化療毒副作用、提高生活質量等方面顯示出絕對優勢。因此，中西醫結合成為我國治療肝癌普遍采用的方法。

端粒酶是一種特殊的核糖核蛋白逆轉錄酶，其在不同物種細胞中對于保持染色體穩定性和細胞活性有重要作用，能延長縮短的端粒，從而增強體外細胞的增殖能力。近年來，國內外學者逐漸認識到端粒酶在腫瘤診治中的重要性，人類超過90%的腫瘤尤其是惡性、晚期腫瘤中，端粒酶的表達都有增加，活性被激活[7]，使得細胞分裂異常活躍。hTERT是決定端粒酶活性的重要因子，其mRNA和蛋白水平的表達即能反映端粒酶的活性[8]。

有研究顯示肝癌細胞中端粒酶及hTERT 均呈高表達[9]，甚至近期還有學者發現hTERT對小肝癌陽性的診斷優于影像學方法，且具有預示肝癌復發和轉移的作用[10]，近年來，現代醫學研究發現RNA干擾技術能明顯抑制靶基因hTERT的表達與肝癌細胞的增殖，但hTERT的mRNA與蛋白表達在細胞實驗中下調比動物實驗中的更加明顯，由此認為該技術應用于體內研究還有待進一步優化[11]。而在傳統中醫藥治療中常基于人體與疾病之間的整體性來用藥，有可能通過中藥加減配伍，調整機體狀態，促進以上技術方法的實現。

有研究發現，中醫中的“毒”與hTERT mRNA的高表達具有相關性，中醫的“解毒法”可干預hTERT mRNA表達，從而治療相關疾病[12]。比如含有大黃的成藥清毒片聯合化療治療急性白血病對hTERT mRNA表達的下調作用顯著優于單純化療[12]，以黃連為主要藥物組成的成藥連黛片能通過減少人大腸癌HT29 hTERT表達來抑制大腸癌細胞的增殖[13]。本課題采用的黃連大黃肉桂復方具有清熱解毒的功效，以往研究發現該復方及其組分配伍(小檗堿、大黃素和桂皮醛)能抑制肝癌細胞增殖[1]。本研究結果顯示，藥物作用后肝癌細胞hTERT的mRNA均有所上調，而蛋白表達均下降，提示該復方及其組分配伍抑制肝癌細胞增殖的作用與hTERT有關，但其作用并不在于抑制hTERT的mRNA轉錄，而是在于hTERT mRNA翻譯成蛋白質的過程，如翻譯和翻譯后加工等，具體機制還有待進一步探索。