基于MAVS介導信號通路的補腎方抗炎抗HBV作用及機制研究*

張景豪 鄭 超 朱曉駿 張 鑫 周振華 李 曼 高月求 孫學華

上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海市中醫(yī)臨床重點實驗室 (上海, 201203)

慢性乙型肝炎(CHB)是世界范圍內的公共健康問題，全球約20億人曾感染HBV，其中約有2.4億慢性HBV感染者[1]。我國是HBV感染的高發(fā)區(qū)，我國肝硬化和HCC患者中，由HBV感染引起的比例分別為60%和80%[2]。當前，抗HBV藥物主要是干擾素和核苷(酸)類似物，但存在著病毒變異耐藥、e抗原(HBeAg)血清學轉換率低、停藥后易復發(fā)、療程長等問題。補腎方是我院治療CHB的有效驗方，主要通對免疫的多環(huán)節(jié)調控作用發(fā)揮其抗炎和誘生干擾素效應。前期體外研究證實，補腎方能夠抑制HepG2.2.15細胞上清液中HBsAg、HBeAg的分泌，顯著上調線粒體抗病毒蛋白(MAVS)的表達，并能明顯夠活化IRF-3，誘導IFN-β的表達，從而發(fā)揮抗病毒作用[3]。我們以ConA誘導的HBV轉基因小鼠肝損傷模型，觀察補腎方對MAVS介導信號通路影響，探討其抗炎、抗病毒作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級HBV轉基因小鼠(BALB/c基因背景)購于中國人民解放軍第458醫(yī)院全軍肝病中心，由原核顯微注射1.3copyHBV全基因組制備，4～6周齡，雄性，動物生產許可證號：SCXK(軍)2012-0018。SPF級BALB/c小鼠購于上海西普爾-必凱試驗動物有限公司，4～6周齡，雄性，動物生產許可證號：SCXK(滬)2013-0016；飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心清潔級動物房，自由飲水，進食標準顆粒飼料。室溫22～26°C,相對濕度40%～60%,適應性飼養(yǎng)1周后使用。

1.2 藥物及試劑 補腎方由生地、枸杞子、菟絲子、淫羊藿、黃芩、虎杖、苦參各15g，肉蓯蓉10g組成(三九醫(yī)藥股份有限公司，批號1505001)，水煎取汁，濃度為1.15 g/mL，保存?zhèn)溆谩onA(VI型C2010)購于Sigma公司；丙氨酸轉移酶(ALT)試劑盒(批號201506)、天冬氨酸轉移酶(AST)試劑盒(批號201512)購于上海將來實業(yè)股份有限公司；干擾素β試劑盒(上海欣博盛生物科技公司，貨號EMC016)、HBsAg試劑盒、HBV DNA試劑盒(上海科華生物公司，201408151);兔單克隆抗TBK-1抗體(貨號ab227182)、兔單克隆抗TRADD抗體(貨號ab110644)、兔單克隆抗STING抗體(貨號ab92605)、兔單克隆抗TAK-1抗體(貨號ab227182)、兔單克隆抗pTAK-1(t183)抗體(貨號ab109526)、兔單克隆抗體FADD(貨號ab124812)、兔單克隆抗體pFADD(pSer194)(貨號SAB4503868)、兔單克隆抗體pFADD(pSer191)(貨號SAB4504752)、兔單克隆抗GAPDH抗體(貨號ab9484)、小鼠單克隆抗乙型肝炎病毒HBsAg抗體(貨號ab859)，小鼠單克隆抗乙型肝炎病毒HBcAg抗體(貨號ab8638)均購于艾博抗(上海)貿易有限公司；Trizol試劑(批號28202，Invitrogen公司)、免疫組化二抗試劑盒(貨號LF-SAB5008，上海優(yōu)寧維生物科技公司)、Western blot實驗所需蛋白裂解液、制膠、電泳等試劑均為碧云天生物技術研究所產品。

1.3 儀器及設備 自動脫水機(LEI CA ASP300)、石蠟包埋機(LEICA EG1160)、輪轉切片機(RM305)、烤片機(HI1220)購自德國Leica公司；垂直蛋白電泳儀、蛋白電轉移購自美國Bio-Rad公司；PCR儀購自德國Eppendorf公司。

1.4 動物分組及造模 將24只HBV轉基因小鼠隨機分為正常組、模型組、補腎方組，另設野生(WT)組，每組8只。模型組、補腎方組小鼠按照3μg/g體重經尾靜脈注射ConA[4]，每周1次，連續(xù)4周，正常組及WT組小鼠予經尾靜脈注射等刻量生理鹽水。造模后補腎方組小鼠每天給予0.3ml補腎方灌胃，按照人用量體表面積換算法補腎方水煎劑給藥劑量為2.25g/kg，正常組、模型組、WT組小鼠予以等量生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)4周。

1.5 標本采集與處理 各組小鼠造模處理結束后，摘眼球取血，室溫靜置30min，離心分離血清后置于-20°C備用；取肝右葉小塊肝組織，10%多聚甲醛固定，脫水石蠟包埋后備用，其余肝組織置于-80°C備用。

1.6 觀察指標與方法

1.6.1 肝功能ALT、AST檢測 按照試劑盒具體實驗步驟，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測小鼠血清ALT、AST水平。

1.6.2 血清HBsAg、DNA檢測 ELISA法檢測血清HBsAg水平，RT-PCR檢測血清DNA水平。

1.6.3 血清IFN-β檢測 按照試劑盒具體實驗步驟，采用ELISA法檢測。

1.6.4 肝組織HE染色與免疫組化 HE染色觀察肝組織病理情況，免疫組化ABC法檢測肝組織內HBcAg表達。

1.6.5 肝組織MAVS介導信號通路關鍵蛋白表達 肝組織低溫電動快速勻漿(100mg加1ml裂解液)提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，制樣，灌膠后每孔上樣30μg，體積10μl，電泳后經半干法電轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2h，一抗(1∶1000)4°C孵育過夜，洗膜后二抗(1∶5000)室溫孵育1h，洗膜后ECL化學發(fā)光法顯影。

2 結果

2.1 補腎方對實驗小鼠肝功能的影響 與正常組比較，模型組小鼠血清ALT及AST水平明顯升高(P<0.001)；與模型組相比，補腎方組小鼠血清ALT及AST水平有明顯下降(P<0.01)；補腎方組與正常組小鼠ALT及AST水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 補腎方對ConA誘導的HBV轉基因小鼠血清肝功能的影響*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，NP>0.05

2.2 補腎方對實驗小鼠血清IFN-β的影響 與正常組相比，模型組小鼠血清IFN-β呈一定程度上升，但差異無統(tǒng)計學意義；經補腎方處理后，小鼠血清IFN-β水平顯著上升(P<0.01)。見圖2。

2.3 補腎方對實驗小鼠血清HBsAg和HBV DNA影響 與正常組及模型組比較，補腎方組小鼠血清HBsAg水平均明顯下降(P<0.05)；模型組與正常組小鼠血清HBsAg水平無統(tǒng)計學差異。與正常組比較，模型組及補腎方組小鼠血清HBV DNA水平無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見圖3。

圖2 補腎方對ConA誘導的HBV轉基因小鼠血清IFN-β的影響

圖3 補腎方對HBV轉基因小鼠血清HBsAg及HBV DNA的影響

2.4 補腎方對實驗小鼠肝組織病理變化影響 HE染色顯示，正常組小鼠肝組織肝小葉結構完整清晰，肝細胞索排列整齊，肝細胞未見明顯變性、壞死，肝血竇正常，無炎性細胞浸潤。模型組肝小葉結構破壞，肝細胞索排列紊亂，可見散在程度不等、大小不一的肝組織壞死區(qū)，并有大量炎性細胞浸潤，部分視野下可見肝細胞脂肪變性。與模型組比較，補腎方組肝細胞變性壞死明顯減少，中央靜脈及匯管區(qū)少量炎性細胞浸潤，未見肝細胞脂肪變性。見插頁圖4。

2.5 補腎方對實驗小鼠肝組織HBcAg表達影響 肝組織免疫組化染色結果顯示，與正常組及模型組相比，補腎方組小鼠肝組織內HBcAg陽性表達明顯下降(P<0.001)。見圖5。

2.6 補腎方對實驗小鼠肝內MAVS介導信號通路關鍵蛋白表達的影響 Western blot結果顯示，與對照組相比，補腎方組小鼠肝組織內TBK-1、STING、pTAK-1(t183)表達均上調，TRADD表達下調(P<0.05)，對FADD、pFADD(pSer194)、pFADD(pSer191)表達無影響(P>0.05)。見圖6。

3 討論

MAVS是RIG-I樣信號通路(RLRs)的下游和NF-κB、IRF-3/7信號通路的上游唯一的接頭蛋白，在先天免疫信號通路中起著關鍵作用。MAVS活化后，可以誘導產生多泛素化TRAF6，并形成了一個包括TAK1激酶和銜接蛋白TAB2在內的復合物。TAK1能激活IKKα/β/γ復合物,使復合物中的IKK-γ通過泛素-蛋白酶體途徑降解[5]，降解后復合物中的IKKβ具有激酶活性,磷酸化IκB,使IκB暴露其泛素化位點，通過蛋白酶體途徑降解，進而活化炎癥因子NF-κB[6]；同時，MAVS也可以活化TRAF2，活化的TRAF2與TRADD復合體(TRADD/FADD/RIP1)相互作用后，使RIP1具有E3泛素連接酶功能并發(fā)生K63連接泛素化，進而招募下游IKKα和IKKβ至NEMO，激活NF-κB通路[7～10]。MAVS也可募集TRAF3并激活TBK1復合體，包括TBK1或多種與IKK相關銜接蛋白，例如TANK、nap1和NEMO。STING可通過與TRAF3相互作用將TBK1和IKKε招募至NEMO從而形成TBK1復合體。TBK1復合體能夠誘導IRF3和IRF7轉錄因子二聚化和磷酸化，并使其轉位到細胞核內，結合干擾素刺激反應元件ISRE(IFN-stimulated response elements)，最終導致I型干擾素表達和一系列干擾素誘導基因產生[5]。

圖5 補腎方對HBV轉基因小鼠肝內HBcAg的影響(IHC,×100) ***P<0.001

圖6 補腎方對實驗小鼠MAVS介導信號通路關鍵蛋白的影響 *P<0.001

古代醫(yī)籍未見慢性乙型肝炎的記載，但根據(jù)其臨床癥狀和體征，可將其歸屬于“黃疸”、“脅痛”、“肝著”、“肝瘟”、“濕阻”、“疫癘”等疾病范疇。本課題組在長期臨床研究發(fā)現(xiàn)“肝腎虧虛，濕熱未盡”是慢性乙型肝炎持續(xù)進展的關鍵病機，根據(jù)“肝腎同源”理論，形成“補腎為主、清化為輔”的補腎方治療慢性乙型肝炎。全方由巴戟天、菟絲子、甜蓯蓉、何首烏、生地、枸杞、虎杖、黃芩、丹參、青皮等藥物組成，方中的巴戟天、菟絲子溫而不熱,健脾開胃,既益元陽,又填陰水；肉蓯蓉、何首烏厚重下降，直入腎脈，溫而能潤，無燥熱之害，能溫養(yǎng)精血而通陽氣；枸杞子滋補肝腎之陰;生地黃養(yǎng)血補陰,有填精補腎之效,且補而不膩；虎杖、黃芩清熱解毒利濕；丹參活血化瘀,青皮起理氣兼引經藥之作用。所選補腎藥溫而不燥，補而不峻，在補腎之同時又可充實肝體，改善肝脾之功能，使“命門火旺，蒸糟粕而化精微”，而達平衡陰陽的作用[11，12]。

本研究結果顯示，補腎方可改善ConA誘導HBV轉基因小鼠肝組織炎癥變性壞死，抑制小鼠血清HBsAg及肝組織內HBcAg的表達，并提高小鼠血清IFN-β水平，上調TBK-1、STING的表達，下調TRADD的表達，提示其作用機制與MAVS介導的信號通路有關。但由于中藥復方成分復雜，作用環(huán)節(jié)及靶點廣泛，補腎方中抗炎及抗HBV作用有效成分及作用機制仍需進一步探討研究。