基因1型戊型肝炎病毒 ORF3對(duì)人外周血來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和活化功能的影響*

彭文舉 田德英 吳 亮

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科 (湖北 武漢， 430030)

戊型肝炎病毒(HEV)是全球范圍內(nèi)引起急性肝炎的最常見(jiàn)的病原體之一，HEV是無(wú)包膜單股正鏈的RNA病毒，分為基因1～4型，病毒RNA全長(zhǎng)約7.2kb，編碼三個(gè)開(kāi)放讀碼框(ORF)。ORF1編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白；ORF2編碼病毒的衣殼蛋白；ORF3編碼一個(gè)多功能小分子磷酸蛋白，其具體功能尚不十分清楚，可能與病毒的裝配，釋放，誘導(dǎo)宿主炎癥反應(yīng)以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)[1～4]。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，戊型肝炎是一種急性、自限性的疾病，但是近十年來(lái)，發(fā)展為慢性化的戊型肝炎病人開(kāi)始被人們識(shí)別且較多的被報(bào)道。然而目前關(guān)于戊肝發(fā)生慢性化的機(jī)制尚不十分清楚。有研究提示，HEV ORF3可能在HEV逃避宿主免疫反應(yīng)[5,6]，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)感染慢性化的過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)是人體功能最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞(APC),不僅可以識(shí)別并提呈抗原，并且能直接激活初始T淋巴細(xì)胞，是機(jī)體免疫反應(yīng)的始動(dòng)者，也是聯(lián)系天然免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的紐帶。本研究通過(guò)構(gòu)建ORF3慢病毒載體，感染人外周血來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞，來(lái)探討基因1型HEV ORF3對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和活化功能的影響，以闡明HEV感染慢性化的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 人淋巴細(xì)胞分離液Ficoll(天津?yàn)?yáng))，重組人白細(xì)胞介素4(rhIL-4)、重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、人TNF-α(美國(guó) peprotech)，RMPI-1640培養(yǎng)基(美國(guó) hyclone),PE標(biāo)記的鼠抗人CD單抗、FITC標(biāo)記的鼠抗人CD80、CD86(美國(guó) ebioscience),人IFN-β、IL-4、IL-10、IL-12 ELISA試劑盒(上海西唐)。實(shí)驗(yàn)所需的外周血均來(lái)源于健康志愿者。基因1型ORF3序列由廈門大學(xué)國(guó)家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心(NIDVD，中國(guó))提供，慢病毒載體的構(gòu)建由武漢金開(kāi)瑞生物工程公司完成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DC的誘導(dǎo)培養(yǎng) 抽取健康男性志愿者肘靜脈血30ml，肝素抗凝。將全血用RMPI-1640培養(yǎng)基1∶1稀釋，將稀釋血以2∶1的比例緩緩加入淋巴細(xì)胞分離液的表面，采用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，800g離心30min。小心吸取單個(gè)核細(xì)胞層，加入5倍的RMPI-1640培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，1200rpm離心10min，即得到PBMC細(xì)胞沉淀。調(diào)整PBMC密度到1×106個(gè)/ml后，種植到6孔板中，放入37°、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h后輕吸去非黏附細(xì)胞,即獲得貼壁的單個(gè)核細(xì)胞。貼壁細(xì)胞以RMPI-1640培養(yǎng)液輕柔洗滌一次,每孔加3ml培養(yǎng)液,添加細(xì)胞生長(zhǎng)因子rhGM-CSF(終濃度100ng/ml)、rhIL-4(終濃度50ng/ml)。培養(yǎng)大約6～7天分化成DCs細(xì)胞。

1.2.2 ORF3慢病毒載體感染DC 誘導(dǎo)的DC分為A、B、C組，A組作為對(duì)照，B組以MOI=0.1加入病毒濃縮液，C組加入不含ORF3的慢病毒對(duì)照，并加入6 μg/ml polybrene，感染12h后改用正常培養(yǎng)基換液，熒光顯微鏡觀察ORF3(GFP標(biāo)記)轉(zhuǎn)染DC。向DC細(xì)胞中加入TNF-α(終濃度20ng/ml)，促進(jìn)DC細(xì)胞成熟。

1.2.3 ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中細(xì)胞因子 分別于ORF3慢病毒載體感染DC 48h后、TNF-α刺激48h后，用雙抗夾心法ELISA試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IFN-β、IL-4、IL-10和IL-12的含量，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志 分別于ORF3慢病毒載體感染DC 48h后、TNF-α刺激48h后，收集細(xì)胞，離心后用100μl PBS重懸細(xì)胞，對(duì)應(yīng)管分別加5μl CD80、CD83、CD86熒光一抗，室溫避光孵育15min。PBS洗滌3次后，用分析型流式細(xì)胞儀(Beckman Cytoflex)檢測(cè)。

1.2.6 DCs對(duì)T細(xì)胞增殖的影響 將上述各組DC細(xì)胞和T細(xì)胞共培養(yǎng)48h，CCK8法檢測(cè)T細(xì)胞增殖情況。

2 結(jié)果

2.1 體外培養(yǎng)不同時(shí)間DC形態(tài)觀察 顯微鏡下觀察可見(jiàn)，分離的PBMC貼壁生長(zhǎng)、形態(tài)單一；rhGM-CSF、rhIL-4刺激2天后，部分細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，細(xì)胞顏色有所加深，細(xì)胞體積有所增大，但細(xì)胞表面仍無(wú)明顯的樹(shù)突樣突起；第6天時(shí)，細(xì)胞體積明顯增大，細(xì)胞大小不一，部分細(xì)胞表面有樹(shù)突樣突起，但突起數(shù)量較少，密度較小，大部分細(xì)胞表面突起不明顯，說(shuō)明此時(shí)的DC成熟度不高，大部分處于不成熟狀態(tài)。見(jiàn)圖1。

A.外周血單個(gè)核細(xì)胞 (100×) B.誘導(dǎo)后2天后的DC (100×) C.誘導(dǎo)后6天的DC (100×)

2.2 ORF3慢病毒成功感染DC GFP標(biāo)記的ORF3慢病毒感染DC 48h后，熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，說(shuō)明ORF3慢病毒載體已經(jīng)成功感染DC細(xì)胞。見(jiàn)插頁(yè)圖2。

2.3 ORF3感染影響DC分泌細(xì)胞因子 ORF3慢病毒感染DC 48h后，和空載組相比，ORF3組DC細(xì)胞上清中IFN-β、IL-4、IL-10和IL-12濃度均降低(P<0.001)。見(jiàn)圖3。

圖3 ORF3對(duì)DC分泌細(xì)胞因子的影響

2.4 ORF3抑制DC細(xì)胞成熟 ORF3慢病毒感染DC 48h時(shí)，和空載組相比，ORF3組DC細(xì)胞CD80、CD83和CD86表達(dá)均顯著下降(P<0.005)。見(jiàn)圖4。

圖4 ORF3對(duì)DC細(xì)胞表面分子表達(dá)的影響

2.5 ORF3對(duì)加入TNF刺激DC成熟的影響 經(jīng)TNF-α刺激，DC細(xì)胞進(jìn)一步成熟，與未加TNF相比，IFN-β、IL-4、IL-10和IL-12濃度明顯上升(P<0.001)，DC表面CD80、CD83和CD86表達(dá)也明顯增多(P<0.05)。ORF3組DC與空載組相比，IFN-β、IL-4、IL-10和IL-12分泌減少(P<0.05)，DC表面CD80、CD83和CD86的表達(dá)也減少(P<0.05)。見(jiàn)圖5、圖6。

圖5 加入TNF后DC上清細(xì)胞因子分泌情況

圖6加入TNF后DC表面分子的表達(dá)情況

2.6 T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)成功 結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后細(xì)胞CD3陽(yáng)性率大于90%，成功誘導(dǎo)出高純度T淋巴細(xì)胞。見(jiàn)圖7。

2.7 ORF3影響DC刺激T細(xì)胞增殖的能力 經(jīng)TNF刺激成熟的DC能夠促進(jìn)T細(xì)胞增殖(P<0.001，圖中未顯示)，而空載組DC刺激T細(xì)胞增殖能力減弱(P<0.005，圖中未顯示)。與空載組相比，ORF3組DC刺激T細(xì)胞增值的能力下降(P<0.001)，說(shuō)明ORF3可以抑制DC對(duì)T細(xì)胞的增殖刺激。見(jiàn)插頁(yè)圖8。

圖7T細(xì)胞誘導(dǎo)后CD3的檢測(cè)

3 討論

慢性戊型肝炎主要發(fā)生在器官移植后、艾滋病病毒(HIV)感染、罹患血液系統(tǒng)惡性腫瘤等免疫力低下或者缺陷的病人中[7]，有報(bào)道指出，器官移植患者感染HEV后60%以上會(huì)發(fā)展為慢性化[8]。病原微生物侵入機(jī)體后，可以迅速的被機(jī)體的固有免疫系統(tǒng)所識(shí)別，進(jìn)而固有免疫活化導(dǎo)致炎癥的發(fā)生，使感染得以局限和控制。DC作為機(jī)體非常重要的固有免疫細(xì)胞，是決定病毒感染后結(jié)局的關(guān)鍵因素。不同的病毒感染后可以對(duì)DC造成不同的影響，有的病毒通過(guò)改變DC的成熟度來(lái)影響疾病的病程[9]。病毒和DC的相互作用是決定病毒迅速被清除還是得以在機(jī)體內(nèi)持續(xù)存在的關(guān)鍵。未成熟DC和成熟DC的表面分子標(biāo)志存在很大差異。未成熟的DC表面MHC-II類分子表達(dá)水平很低，共刺激分子和粘附分子表達(dá)也很少。但是卻高表達(dá)FcR和病原體受體，成熟DC表面表達(dá)大量MHC-II類分子，粘附分子和共刺激分子(CD80、CD86等)，但是FcR和病原體受體的表達(dá)卻基本消失。CD83是DC的特異性表面分子標(biāo)志，且CD83在未成熟DC表達(dá)甚微，而在成熟的DC細(xì)胞中卻大量表達(dá)[10]。

DC除了可以將抗原提呈給T淋巴細(xì)胞外，還可以分泌大量的細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)。DC可以產(chǎn)生IL-12，誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞方向分化，從而增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答。同時(shí)也可以產(chǎn)生較高水平的IL-4誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞方向分化，增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答。除此之外，DC還可以產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和趨化因子，如IL-1、IL-18、IFN-β等調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答。本研究表明ORF3可以抑制DC分泌IL-12、IL-4、IL-10和IFN-β等，這樣就導(dǎo)致機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫同時(shí)收到影響，同時(shí)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)能力下降，這樣就導(dǎo)致HEV長(zhǎng)期在體內(nèi)不能夠有效清除，從而導(dǎo)致戊肝慢性化的發(fā)生。

成熟的DC還可以刺激T細(xì)胞增殖，使T細(xì)胞的數(shù)量迅速增加，快速調(diào)動(dòng)機(jī)體的免疫系統(tǒng)。然而，HEV ORF3卻可以削弱這一作用，使T細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)緩慢，使機(jī)體不能夠短期內(nèi)清除病毒，導(dǎo)致病毒在體內(nèi)長(zhǎng)期存在而發(fā)生慢性化。如前所述，ORF3的這一作用可能跟CD83的下降有關(guān)，也可能有多種機(jī)制參與，需要進(jìn)一步的研究。

上面所述就是本研究對(duì)于戊型肝炎發(fā)生慢性化的原因的一點(diǎn)解釋。但是，還需要更多的證據(jù)來(lái)證明。同時(shí)，ORF3抑制DC的具體機(jī)制是什么，通過(guò)什么信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)，有哪些關(guān)鍵性的分子參與了這一過(guò)程？這都需要更深入的研究。