基于LPS/TLR4通路研究疏肝理脾湯治療NASH大鼠的作用機制*

王 雅 劉玉娟 代 靜 張 濤△

1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院 (湖南 長沙， 410007) 2.湖南中醫藥大學

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是指在非酒精性肝病(NAFLD)基礎上，肝臟發生炎性細胞浸潤的一種病理表現，是進展為肝纖維化、肝硬化，甚至肝癌的必經步驟[1]。近年來，多項研究證實NAFLD患者腸道菌群失調導致增殖的脂多糖(LPS)激活Toll樣受體(TLR4)信號通路，引發炎性/負炎性細胞因子嚴重失衡[2]，從而導致NASH發生及進展。本課題組基于中醫“肝病實脾理論”，認為NASH病因病機均與“脾虛”相關，在前期以“健脾、益氣、活血、利濕”為代表的“實脾理論”治療NASH的臨床研究中發現，其在改善中醫癥候、肝功能、血脂水平等方面具備優勢[3、4]。以“疏肝健脾活血”立法的疏肝理脾湯源于疏肝健脾名方柴芍六君湯，在我院近40年的臨床應用實踐表明，其在改善肝臟炎癥、纖維化方面療效顯著，是我院治療慢性肝病經典復方。故本研究擬從LPS-TLR4信號通路角度出發，探討基于“疏肝健脾活血法”立方的疏肝理脾湯治療NASH的干預機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取健康、成年清潔級SD雄性大鼠100只，體質量(180 g±10 g)，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物中心提供，許可證號：SYXK(湘)2013-0005，飼養于湖南中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物中心。

1.2 藥物制備 疏肝理脾湯組成(成人劑量)：柴胡、茯苓、白芍各15 g、茜草、白茅根、地龍各10 g、湘曲、砂仁、鱉甲各5 g組成。所有中藥由湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科提供。采用傳統中藥熬制方法煎制，經水浴濃縮至生藥含量2.0 g/ml,4℃保存備用。蛋氨酸膽堿缺乏(MCD)配方：L-氨基酸175.7 g/kg、玉蜀黍淀150 g/kg、右旋麥芽糖50.0 g/kg、纖維素30.0 g/kg、玉米油100.0 g/kg、碳酸氫鈉7.4 g/kg、鹽混合物35.0 g/kg、維生素混合物10.0 g/kg)。購自南通特洛菲飼料科技有限公司。

1.3 實驗試劑 TLR4抗體(Abcam公司)，TLR引物(生工生物工程(上海)股份有限公司)，HPR標記的羊抗兔二抗(Proteintech公司;型號：SA00001-2)，微量移液器(德國Eppendorf公司)，Tirol( 生工生物工程(上海)股份有限公司;型號B610409)，一步法反轉錄熒光定量試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司;型號B639277]，RIPA蛋白裂解液(CWBIO；CW2334S)，5X SDS-PAGE loading buffer(CWBIO，CW0027S)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(CWBIO，CW0014S)；彩色預染蛋白marker(Therm(Fermentas)，26616)；速泳SDS-PAGE電泳液(CWBIO，CW2566)，SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(CWBIO，CW0022)；Western抗體稀釋液(CWBIO，CW2340S)；PVDF膜0.45um(millipore，IPVH00010)；PVDF膜 0.22um(millipore，ISEQ00010)；BSA(roche，G5001)；TWEEN 20(Solarbio，T8220)；化學發光檢測試劑盒(CWBIO，CW0049)；羊抗鼠二抗(PROTEINTECH，SA00001-1)；羊抗兔二抗(PROTEINTECH，SA00001-2)。

1.4 實驗方法

1.4.1 造模階段 適應性喂養1周后，隨機選取10只大鼠進入對照組，給予正常飲食，剩余 90只入實驗組，實驗組給予MCD飲食，投食量每只為10 g/100 g體重，飲水量每天為12 ml/100 g體質量。各大鼠每周分別稱重，按相應體重調整投食及飲水量，根據大鼠生長情況，每天稱重調整攝食量及飲水的用量。在給予相應飼料后，每天觀察動物進食、飲水、行為、活動、精神狀態、毛發及大小便等情況。共飼養5周后，隨機抽取6只大鼠進行肝臟病理切片檢測，評判造模是否符合人類NASH 病情演變和病理特點。光學顯微鏡下觀察造模組可見廣泛彌漫性大泡性脂肪變性及肝細胞氣球樣變，腺泡內可見明顯點、灶狀壞死，散在可見淋巴細胞、炎性細胞浸潤；正常組肝細胞形態規則,胞漿清透，大小一致，肝竇清晰，提示造模成功。

1.4.2 分組與給藥 造模成功后，將84只大鼠按隨機原則分為6組，每組14只，其中兩組為無中藥干預對照組，分別繼續予以MCD飲食(MM組)和正常飲食(MN組)，給予等量蒸餾水灌服；兩組為繼續MCD 飲食加中藥干預，中藥干預分為中藥低劑量(D低組)、高劑量(D高組)；兩組為正常飲食加中藥干預，分為中藥低劑量(Z低組)、高劑量(Z高組)。另設對照組(N組)，為同批次非造模大鼠，不做藥物處理。

參照陳奇主編《中藥藥理研究方法學》第2版(2006年人民衛生出版社)計算給藥劑量，大鼠與成人的換算系數Rab為0.162，根據換算公式，換算出大鼠的給藥量為3.09 g/kg(中劑量)。疏肝理脾湯低、高給藥劑量比例為1∶4。使用蒸餾水將中藥湯劑配成低濃度、高濃度分別為0.07 g/ml、0.31 g/ml備用。復方中藥制劑，蒸餾水給予時間均為每日14∶30，持續4周,于實驗9周末處死所有動物。

1.4.3 標本采集 予3.5%水合氯醛1 ml/100 g腹壁下麻醉注射，腹主動脈取血，分離血清。濾紙吸濕后，取0.3 g肝組織，放入玻璃杯中，加入0.9%氯化鈉溶液，4℃，3500 r/min離心機離心10 min，勻漿提取上清液。

1.4.4 指標檢測 療程結束后，取腹主動脈血，羅氏全自動生化分析儀檢測血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)。用ELISA法檢測腫瘤壞死因子(TNF)-α。取門靜脈血1 ml，離心后取血漿，按照鱟試劑盒說明說操作檢測LPS。細胞炎癥因子檢測用ELISA 法檢測血清中TNF-α、IL-6、IL-1含量。肝組織勻漿液予實時熒光定量PCR 法檢測TLR4mRNA，各組大鼠按照TLR4試劑盒說明書進行相關RNA抽提，反轉錄成cDNA,TLR4上游引物GAGGCAGCTCTTGGTGGAAGTTG；下游引物CAAGCACACTGAGGACCGACAC，產物長度137bp。依次進行梯度PCR擴增,PCR產物電泳操作，凝膠成像系統觀察。

Western Blot實驗步驟：組織總蛋白提取：(1)組織塊用冷PBS洗滌2～3次，去除血污，剪成小塊置于勻漿器。加入10倍組織體積本試劑(使用前數分鐘內加入蛋白酶抑制劑)冰上徹底勻漿。如果需要提高蛋白濃度，可以適量減少該試劑體積。(2)將勻漿液轉移至1.5 ml離心管中，振蕩,冰浴 30min，期間用移液器反復吹打，確保細胞完全裂解。(3)12 000 g離心10 min，收集上清液，即為總蛋白溶液。蛋白濃度測定：BCA法測蛋白濃度；SDS-PAGE電泳。

1.5 SAF積分評判標準 大鼠肝組織病理學評分標準參考非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018年更新版)關于肝組織活檢采用歐洲脂肪肝協組織提出的肝臟炎癥活動積分SAF積分(肝脂肪變+肝細胞損傷+炎癥壞死)進行判斷[1、5]。SAF計分=肝脂肪變+氣球樣變+小葉炎癥；SAF<3分，排除NASH，SAF>4診斷NASH，介于兩者間，伴有小葉炎癥，氣球樣變診斷為NASH。

2 結果

實驗結束后，N組大鼠無死亡，因麻醉意外，MN組死亡1只大鼠、Z高組、MM組分別死亡2只大鼠，因灌胃操作失誤，MN組、MM組、D高組、D低組各死亡1只大鼠。

2.1 肝臟組織肉眼表現 N組大鼠肉眼見呈紅褐色，邊緣銳利，被膜光滑，觸診質地柔軟，有彈性；MN組、MM組大鼠肉眼見呈黃褐色，體積較正常組稍大，表面可見散在白色斑點，觸診質地有油膩感；Z高組、Z低組、D高組、D低組肉眼見呈黃褐色，體積較正常組稍大，觸診質地稍柔軟伴有油膩感，彈性較正常組稍減弱。

2.2 肝組織病理學表現 電鏡下N組大鼠肝小葉及肝竇結構完整，肝索排列完整且清晰可見，無脂肪變及氣球樣變。MN、MM組大鼠肝小葉和肝竇結構欠完整，肝索排列紊亂，可見明顯脂肪變，伴隨大量氣球樣變，腺泡內可見大量點灶狀壞死，門管區稍見星芒狀纖維化；Z高組、Z低組、D高組、D低組可見輕、中度脂肪性變，可見散在氣球樣變，腺泡內可見散在點灶狀壞死。

2.3 各組大鼠SAF積分表 見表1。

表1 各組大鼠SAF積分

與N組比較，*P<0.05;與MN組比較，#P<0.05；與MM組比較，☆P<0.05,△P<0.01；與Z高組比較，#P<0.05；與Z低組比較，&P<0.05。

2.4 各組大鼠血清學指標結果 見表2。

表2 各組大鼠血清生化指標比較

與N組比較，*P<0.05,與MN組比較，△P<0.05，與MM組比較，▲P<0.05; 與Z高組比較，

#P<0.05；與Z低組比較，&P<0.05, 與D高組比較，@P<0.05。

2.5 血清細胞炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1檢測結果 見表3。

表3 各組大鼠血清細胞炎癥因子比較

與N組比較，*P<0.05；與MN組比較，△P<0.05；與MM組比較，☆P<0.05，與Z高組比較，#P<0.05；與Z低組比較，&P<0.05

2.6 血漿LPS水平比較結果 見表4。

表4 各組大鼠血漿LPS水平比較

與N組比較，*P<0.05;與MN組比較，△P<0.05；與MM組比較，

☆P<0.05,△P<0.01；與Z高組比較，#P<0.05；與Z低組比較，&P<0.05

2.7 實時熒光定量PCR法測肝組織 TLR4mRNA結果 見表5。

表5 各組大鼠肝組織TLR4mRNA表達比較

與N組比較，*P<0.05;與MN組比較，△P<0.05；與MM組比較，

☆P<0.05；與Z高組比較，#P<0.05；與Z低組比較，&P<0.05

2.8 Western Blot法測TLR4蛋白水平的表達灰度分析結果 見表6、圖1。

表6 各組大鼠肝組織中TLR4蛋白靶基因/actin比值比較

與N組比較，*P<0.05;與MN組比較，△P<0.05；與MM組比較，☆P<0.05；與Z高組比較，#P<0.05；與Z低組比較，&P<0.05

圖1 Western Blot法TLR4蛋白印跡圖

3 討論

中醫理論對于NASH無特定病名，多依照“痞病”、“肥胖病”、“肝癖”、“肝痞“、“脅痛”等疾病論治，其病因病機復雜，早期多見脾氣虛，繼之肝郁氣滯，脾虛益甚，日久肝脾腎俱虛，但無論是肝郁還是腎虛，都與脾密切相關[6]。“肝病實脾”理論源于《金匱要略》“夫治未病者，見肝之病，知肝傳脾，當先實脾”，“實脾”已涵蓋“疏肝、健脾、祛濕、化瘀”諸治法，故基于“肝病實脾”理論指導NASH臨證論治是目前中醫治療NASH主要理論之一[7]。

以“疏肝健脾活血”立法的“疏肝理脾湯”是我院治療慢性肝病經典復方，其源于疏肝健脾名方“柴芍六君湯”。該方由柴胡、茯苓、白芍、茜草、白茅根、地龍、湘曲、砂仁、鱉甲組成。方中柴胡疏肝行氣為君，茯苓益氣健脾，健胃消食為臣，白芍養血柔肝為佐，地龍、湘曲、砂仁、鱉甲滋陰潛陽，健脾消食為佐。在我院近40年的臨床應用實踐表明，對改善各類慢性肝病肝臟炎癥、纖維化方面，尤其伴有腹脹、腹瀉，大便不調等“脾虛”癥狀臨床療效顯著。

TLR4隸屬于表面模式識別受體(PRR),是存在于細胞膜的一種跨膜蛋白，通過識別特異性LPS的細胞膜受體，激活肝星狀細胞、巨嗜細胞等，是NASH中關鍵的炎癥信號通路[8～9]。研究證實內毒素越過腸道屏障進入腸壁組織、腸系膜淋巴結，通過門靜脈進入肝臟，參與刺激TLR4蛋白表達，激活機體免疫介導的IL-4、IL-6炎癥細胞因子增殖，從而導致腸源性內毒素血癥形成，是NASH重要發病機制之一[10]。臨床試驗研究證實NASH 受試者肝組織中TLR4表達明顯高于正常受試者表達，且與炎癥程度和纖維化程度呈正相關；大量增殖的革蘭陰性菌和LPS，與門靜脈血漿內毒素水平呈正相關。上述研究說明內毒素聚集啟動固有免疫反應，激活TLR4信號通路，引發炎性/負炎性因子嚴重失衡，誘導肝臟的炎癥反應, 從而促進NAFLD進展為NASH[11]。故減少腸源性LPS血癥，抑制肝臟組織TLR4信號表達，從而減輕脂肪肝相關炎性反應，已成為治療NASH的新策略。

本研究以中醫理論為指導，結合多年我院臨床實踐，予疏肝理脾湯治療NASH大鼠，研究結果顯示：從肝臟組織病理上，證實具有縮小肝細胞脂變范圍，減輕炎性細胞浸潤的作用；從生化學檢測，發現具有顯著降低其外周血ALT、AST、TC、TG、IL-1、IL-6及TNF-α水平的作用；以上結果說明疏肝理脾湯具有較強的降低血脂、保護肝細胞、減輕NASH炎癥細胞增生反應作用。本研究同時對LPS/TLR4信號通路相關指標進行檢測，結果顯示疏肝理脾湯干預治療后，可顯著降低NASH大鼠血漿LPS水平、抑制肝臟組織TLR4信號表達；進一步分析以疏肝理脾湯高、低劑量、繼續MCD飲食及正常飲食不同的四組，進行兩兩比較發現，疏肝理脾湯高劑量聯合正常飲食組的以上述指標評價的療效優于其余三組。

綜合上述研究，“疏肝健脾湯”對NASH大鼠的干預機制可能與其影響LPS/TLR4信號通路，從而達到抑制相關炎癥細胞因子分泌，減輕肝細胞炎性反應及脂肪變性的目的。本研究同時發現通過改變飲食，療效得到顯著提高，其機制有待下一步深入研究。