外泌體中的miRNA-744-5P調控骨肉瘤細胞轉移的體外實驗研究

李耀璽 楊文杰 段莉 王大平（通訊作者）

（1 安徽醫科大學深圳二院臨床學院 安徽 合肥 230032）

（2 深圳市第二人民醫院組織工程實驗室 廣東 深圳 100730）

骨肉瘤是兒童和青少年中最常見的惡性骨腫瘤[1]。骨肉瘤是一種遺傳學上不穩定且高度惡性的骨間充質腫瘤，其可以產生類骨質基質和纖維間質[2]。本實驗的研究意義在于：（1）構建4種骨肉瘤細胞的miRNA表達譜，尋找不同轉移性骨肉瘤細胞外泌體中miRNA的表達差異。（2）利用外泌體中的miRNA為媒介，為探究骨肉瘤細胞的轉移性提供新的依據（3）結合臨床患者數據，探究外泌體中的miRNA成為一個預后因子的可能性。

1.資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 細胞系來源

骨肉瘤細胞株MG63(上海中國科學院細胞庫)；

骨肉瘤細胞株Saos2(上海中國科學院細胞庫)；

骨肉瘤細胞株U2OS(上海中國科學院細胞庫)；

骨肉瘤細胞株HOS(上海中國科學院細胞庫)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養與傳代 骨肉瘤細胞株Saos2、U2OS使用含有10%胎牛血清和雙抗（1%的青霉素和鏈霉素）的McCoy’5A培養基，HOS、MG63使用含有含有10%胎牛血清和雙抗（1%的青霉素和鏈霉素）的MEM培養基,培養條件均為：37℃，5%CO2,飽和濕度的環境中，2～3天更換新鮮培養基1次。實驗所用均取處于對數生長期的細胞。

1.2.2 外泌體的收集 細胞上清中的外泌體收集主要通過梯度超速離心法。

1.2.3 轉染實驗 用于轉染的miRNA-744-5P inhibitor序列5’-3’：UGCUGUUAGCCCUAGCCCCGCA

該產品購自蘇州泓迅生物科技公司，miR-744-5P inhibitor是miRNA抑制物，本實驗中即反義RNA寡聚物anti-miRNA，是化學修飾的成熟miRNA互補單鏈，產品為凍干粉形成的即用型試劑，使用前瞬時離心，用RNase-free H2O或滅菌dd H2O配制成20μM儲存液，分裝保存，避免反復凍融（應＜5次）。

20μM儲存液的配制方法（1:50）

1.2.4 Transwell細胞遷移實驗 選用購自美國corning公司的Transwell聚碳酯膜鑲嵌套，每皿6孔，聚碳酯膜直徑24mm，孔徑8μm。選用高轉移性的骨肉瘤細胞Saos2、U2OS進行miRNA-744-5P inhibitor的轉染實驗（如上述）。分別對比轉染前后根據說明書進行細胞遷移實驗。

2.結果

2.1 4種骨肉瘤細胞的形態學觀察

4種骨肉瘤細胞貼壁生長，其中Saos2和MG63呈梭型,HOS與U20S呈類圓形。

2.2 高通量測序及實時定量PCR

高轉移性骨肉瘤細胞與低轉移性骨肉瘤細胞差異最明顯的miRNA，實時定量結果，高轉移組在細胞內和細胞外miRNA-744-5p 表達均高于低轉移組。

2.3 Transwell實驗結果

首先我們利用Transwell驗證了Saos2、U2OS的高轉移性，經過48小時的遷移后，Saos2、U2OS確實有大量的細胞突破了膠質層，遷移到了內室的下方，刮除內室殘余細胞，經過結晶紫染色后，可見大量藍紫色的細胞。

3.討論

3.1 外泌體的收集方法

本研究首先針對4種骨肉瘤細胞的上清進行了大量的收集工作，再使用梯度超高速離心法獲得4種骨肉瘤細胞的外泌體，將4種細胞內和細胞外的小分子RNA同時進行測序，本實驗采用的是梯度超速離心法，梯度超速離心法是經典的提取外泌體的方法。具體操作步驟見實驗記錄，此方法耗時較長且成本較高，要求實驗室配備超速離心機和較大的離心起始體積。

3.2 細胞遷移實驗

Transwell實驗是基于Transwell小室評估細胞遷移性的經典實驗。我們選取美國corning公司的Transwell實驗板，對4種骨肉瘤細胞進行了Transwell實驗。在進行了miRNA-744轉染實驗后，高轉移性的骨肉瘤細胞Saos2、U2OS表現了轉染前明顯的差異性，低轉移性的骨肉瘤細胞HOS、MG63在轉染前后未見明顯異常。

4.結論

miRNA-744-5P在不同轉移性的骨肉瘤細胞之間具有明顯的表達差異，抑制骨肉瘤細胞中miRNA-744-5P的表達可以抑制骨肉瘤細胞的遷移能力。