多孔金屬支架組織學標本體內(nèi)體外的切片及染色方法

李靜 孫立國 呂榮 趙成相 吳拮（通訊作者）

（空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院骨科研究所 陜西 西安 710032）

目前病理學對組織切片染色要求越來越高，不脫鈣骨、陶瓷材料、金屬組織用塑料包埋切片染色已經(jīng)應用廣泛。而金屬支架上培養(yǎng)細胞，目前在文獻上報道用電鏡掃描能觀察到細胞核，經(jīng)我室實驗研究得出，用Leica1600型鋸式切片機切片，其厚度為200～300μm，經(jīng)過磨片厚度為50μm用HE染色，結果支架間成骨細胞清晰。用靜態(tài)培養(yǎng)的細胞支架復合物植到動物體內(nèi)，組織經(jīng)切片磨片后，用Van Gieson（V-G）染色法染色，結果支架內(nèi)成骨和類骨質(zhì)明顯。

1.材料與方法

1.1 取材

支架材料由西南交通大學材料學院制備，制造基本原理是用快速成形對金屬直接制造技術以及電子束融化成型技術制備而成。一部分支架用于體外，將配制好的2ml細胞懸液，每隔5分鐘滴于支架組織上，滴完為止，用靜態(tài)培養(yǎng)1d、7d、14d，PBS液沖洗；另一部分把7d的細胞支架復合物植到動物（兔）體內(nèi)，4、8、12、16W分別取材，用10%福爾馬林固定后，流水沖洗半小時，梯度酒精脫水，二甲苯透明。

組織經(jīng)塑料I液、Ⅱ液、Ⅲ液分別浸潤5～7d。包埋液包埋。貼上標簽，將玻璃瓶放入抽真空泵內(nèi)抽5h以上，玻璃瓶加蓋，放入48℃水浴鍋內(nèi)聚合，完全凝固后，將玻璃瓶放入-20℃冰箱內(nèi)15min，拿出將玻璃瓶砸碎即可。

1.2 切片

用萊卡1600型切片機切片，切片200～250μm厚，再用砂紙將有機載玻片一面的邊緣打磨成2厘米毛邊，然后用1～2滴502膠水滴于載玻片另一面2/3處粘片，并輕壓切片，以免產(chǎn)生氣泡，待膠干透，方可麿片。

1.3 磨片

用千分尺測量磨片前厚度，用1500#砂紙放在骨組織試樣研麿機上麿片，邊磨邊加涼水，以免產(chǎn)生高溫損傷組織。然后在拋光機上加拋光膏拋光。顯微鏡觀察切片光亮且無劃痕，千分尺監(jiān)測量厚度，最終厚度為30～50μm。

1.4 染色

1.4.1 HE染色法 切片磨片拋光厚度為50μm，將切片放入蘇木精染液加熱至60℃ 2.5小時，水洗5分鐘，用1%鹽酸乙醇分化15秒，水洗2分鐘，稀氨水返藍1分鐘，水洗2分鐘，用80%乙醇脫水1分鐘，伊紅染色2分鐘，水洗2分鐘， 晾干即可。

1.4.2 Van Gieson（V-G）染色法 切片磨片拋光厚度為50μm，超聲洗片3分鐘，流水沖洗3分鐘，滴加0.1%甲酸3分鐘，流水沖洗3分鐘，滴加20%甲醇2分鐘，流水洗滌2分鐘，恒溫60℃下Stevenol藍染色3分鐘，60℃蒸餾水洗滌1分鐘，擦干，室溫下苦味酸—品紅染色15分鐘，水洗，晾干即可。

2.結果

多孔金屬支架組織經(jīng)塑料包埋，用Leica1600型鋸式切片機切片，其厚度為200～300μm，經(jīng)過磨片厚度為50μm，用HE染色，結果多孔金屬支架深黑色，細胞核藍色，胞漿紅色（圖1）。用Van Gieson（V-G）染色法染色，結果多孔金屬支架深黑色，膠原纖維綠或青，成骨橙或深紅，類骨質(zhì)黃綠，肌纖維藍或青（圖2）。

圖1 HE染色×50

圖2 V-G染色×50

3.結論

多孔金屬支架組織堅硬，需要通過不脫鈣硬組織包埋法，采用Leica 1600型鋸式切片機，雖可切出完整的切片，切片厚度200～300μm。但因切片太厚，顯微鏡下觀察，顏色不鮮亮，細胞核較模糊，無法觀察到骨細胞核和軟骨細胞核，只能采集到低倍的圖片，也不能很好區(qū)別不同的組織結構。現(xiàn)如今組織形態(tài)學的研究對硬組織切片處理要求越來越精細，而現(xiàn)有的切片和染色方法難以滿足實驗需要。通常用的塑料包埋硬組織切片，雖可切出8μm厚完整切片，但由于鈦合金和人工骨材料堅硬，韌性差，一般烏鋼刀無法切出完整的切片。

目前在文獻上報道用電鏡掃描能觀察到細胞核，經(jīng)我室實驗研究得出，用Leica1600型鋸式切片機切片，其厚度為200～300μm，經(jīng)過磨片厚度為50μm，用HE染色，結果支架間成骨細胞清晰。用靜態(tài)培養(yǎng)的細胞支架復合物植到動物體內(nèi)，組織經(jīng)切片磨片后，經(jīng)Van Gieson（V-G）染色法染色，結果支架內(nèi)成骨和類骨質(zhì)明顯。同時對多孔金屬支架組織形態(tài)學計量參數(shù)的測量提供了可靠的依據(jù)。