牡丹花黃酮的超聲輔助提取工藝研究

竇勇博，王成忠

（齊魯工業大學＜山東省科學院＞食品科學與工程學院，山東濟南250353）

牡丹屬芍藥科植物，原產中國西部秦嶺和大巴山一帶，為多年生落葉小灌木。牡丹生長慢、株型小，是我國特有的木本名貴花卉，有數千年的自然生長和1 500 多年的人工栽培歷史，素有“國色天香”“富貴之花”“花中之王”等美稱。牡丹花具有重要的藥用價值，含有紫云英苷、沒食子酸、苯甲酸等黃酮、多酚化合物[1]。黃酮類化合物（flavonoids）又稱黃體酮、生物類黃酮、黃堿素、維生素P，泛指兩個具有酚羥基的苯環（A-與B-環）通過中央三碳原子相互連結而成的一系列化合物，其基本母核為2-苯基色原酮。近年來隨著對黃酮類化合物研究的不斷深入，許多天然黃酮類化合物被開發出來，發現其對機體有許多生理活性，如清除自由基、抗氧化、抗衰老、抗癌、抗腫瘤、抗過敏、抗菌、抗炎、抑制酶的活性、防止血管舒張等作用[2,3]。另外，黃酮類化合物在食品醫藥領域的應用前景也非常廣闊[4,5]。在牡丹花黃酮的提取方面，目前研究還非常少。王曉等[6]研究了酶法提取牡丹總黃酮的工藝條件。王亮生等[7]在研究牡丹花成色機理時，對西北牡丹中的黃酮種類和含量進行了探索。

黃酮類化合物常用的提取方法有水提法、有機溶劑提取法、堿液提取法、微波提取法、超聲波提取法、超臨界流體萃取、半仿生提取法及酶解法等。用超聲波提取法提取黃酮類物質，與普通的有機溶劑提取法相比具有提取效率高、操作方便、溫度低、提取時間短等優點[8-10]。本試驗使用超聲波輔助法提取牡丹花中總黃酮，并通過單因素試驗和正交試驗優化得到最佳的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

XFB-400 小型植物粉碎機，吉首市中誠制藥機械廠；RE100-Pro 旋轉蒸發儀，上海人和科學儀器有限公司；UV-1800 紫外可見分光光度計，島津國際貿易有限公司；SHB-III 水循環真空泵，北京博遠祥德科學儀器有限公司；DHG-9140A 電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；KQ-300DB 數控超聲波清洗器，北京卓信偉業科技有限公司；YP3001N 電子天平，上海精密科學儀器有限公司；HW·SY21-K 電熱恒溫水浴鍋，北京市長風儀器儀表有限公司。

1.2 材料與試劑

試驗采用菏澤地區栽種的牡丹花，以曬干的牡丹花為原料，烘干后破碎打粉備用。

蘆丁，天津大茂化學試劑廠；乙醇，天津大茂化學試劑廠；三氯乙酸（TCA），天津大茂化學試劑廠；所有試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的制備

（1）對照品溶液的配制

精確稱量蘆丁10.0 mg，用70%乙醇溶解，稀釋定容至50 mL，配成0.2 mg/mL 的對照品溶液。

（2）顯色劑的配制

精密稱取AlCl3·6H2O 2.42 g，用70%乙醇定容至100 mL，配成0.1 mol/mL 的顯色劑溶液。

（3）繪制標準曲線

從蘆丁對照品溶液中精密移取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 溶液，加入1 mL、0.1 mol/L 的顯色劑，用70%乙醇定容至25 mL。搖勻，充分顯色15 min，在412 nm 處測吸光度。以不加蘆丁對照品溶液為對照，制備標準曲線。

1.3.2 樣品中黃酮含量的測定

將低溫冷凍的牡丹花于50 ℃低溫烘干，粉碎機破碎，精確稱取一定質量的牡丹花粉末（1.0 g），以一定體積分數的乙醇溶液為溶劑，在一定的料液比下，超聲輔助浸提一段時間后，浸提液經抽濾后加入相應濃度的乙醇，定容于100 mL 容量瓶中作為提取液。吸取1 mL 提取液，加入1 mL、0.1 mol/L 的顯色劑，用70%乙醇定容至25 mL。搖勻，充分顯色15 min，在412 nm 處測吸光度，代入回歸方程，計算提取液中黃酮的含量[11]。

1.3.3 黃酮不同提取方法的比較

（1）傳統浸提法

精確稱取牡丹花粉末1.0 g，以70%的乙醇溶液為溶劑，料液比為1：30，在60 ℃恒溫水浴中浸提2 h，浸提液經抽濾后定容。吸取1 mL 提取液，加入1 mL、0.1 mol/L的顯色劑，用70%乙醇定容至25 mL。搖勻，充分顯色15 min，在412 nm 處測吸光度，代入回歸方程，計算提取液中黃酮的含量。

（2）超聲波輔助提取法

精確稱取牡丹花粉末1.0 g，以70%的乙醇溶液為溶劑，料液比為1：30，超聲輔助浸提30 min，浸提液經抽濾后定容。吸取1 mL 提取液，加入1 mL、0.1 mol/L 的顯色劑，用70%乙醇定容至25 mL。搖勻，充分顯色15 min，412 nm 處測吸光度，代入回歸方程，計算提取液中黃酮的含量。

1.4 超聲波輔助提取黃酮的單因素試驗

1.4.1 乙醇濃度對提取液中黃酮含量的影響

精確稱取牡丹花粉末1.0 g，分別以不同體積分數（40%、50%、60%、70%、80%）的乙醇溶液為提取溶劑，料液比為1：30，60 ℃、280 W 超聲提取40 min，抽濾定容，然后測定黃酮含量。

1.4.2 料液比對提取液中黃酮含量的影響

料液稱取牡丹花粉末（1.0 g），以60%的乙醇溶液為提取溶劑，料液比分別為1：20、1：30、1：40、1：50、1：60，60 ℃、280 W 超聲提取40 min，抽濾定容，然后測定黃酮含量。

1.4.3 超聲時間對提取液中黃酮含量的影響

準確稱取牡丹花粉末（1.0 g），以60%的乙醇溶液為提取溶劑，料液比為1：30，在60 ℃、280 W 超聲波分別超聲提取20、30、40、50、60 min，抽濾定容后，測定黃酮含量。

1.4.4 超聲溫度對提取液中黃酮含量的研究

精密稱取牡丹花粉末1.0 g，以60%的乙醇溶液為提取溶劑，料液比為1：30，分別在40、50、60、70 ℃條件下，280 W 超聲提取40 min，抽濾定容后，測定黃酮含量。

1.5 超聲波輔助提取黃酮的正交試驗

在單因素試驗的基礎上，進行L9(34)正交試驗，試驗設計見表1。

表1 正交試驗設計因素水平表Table 1 The factor and level table of orthogonal test

2 結果與討論

2.1 蘆丁標準曲線的制備

經線性回歸，得到溶液濃度（x）與吸光度（y）關系曲線的回歸方程為y=36.97x+0.011，R2=0.998。可見，在所試驗的濃度范圍內，溶液濃度（x）與吸光度（y）呈現良好的線性關系。

2.2 超聲波提取法與傳統浸提法的對比

表2 超聲波提取法與乙醇浸提法的比較Table 2 Comparison between ultrasonic extraction method and ethanol extraction

由表2 可知，超聲波提取法牡丹花總黃酮提取率為2.48%，而傳統浸提法黃酮的提取率為1.93%，超聲波的提取效果比傳統浸提法提高了0.55%。在其他條件相同的前提下，超聲波法提取時間僅需40 min，與傳統浸提法相比，具有省時、提取率高、設備簡單等優點。因此，本試驗采用超聲波輔助法提取牡丹花黃酮。

2.3 單因素試驗結果

2.3.1 乙醇濃度對牡丹花黃酮提取率的影響

圖1 顯示了乙醇濃度對提取液中黃酮含量的影響，由圖可知，隨著乙醇溶液濃度的升高，牡丹花總黃酮的提取率不斷增加，但當乙醇濃度高于60%時，提取率反而下降。原因可能是天然植物中的黃酮類化合物多以苷類形式存在，而黃酮苷在低濃度乙醇中溶解度較高，在高濃度乙醇中溶解度反而降低，結果導致提取率也隨之下降。因此，用于牡丹花黃酮提取的乙醇濃度選擇60%。

圖1 乙醇濃度對黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of flavonoids

2.3.2 料液比對牡丹花黃酮提取率的影響

圖2（見下頁）顯示了料液比對提取液中黃酮含量的影響，由圖可知，隨著料液比的減小，牡丹花黃酮的提取率不斷增加，但當料液比達到1：30 時，提取率接近平穩。原因可能是隨著料液比的減小，牡丹花的黃酮不斷溶解，但是牡丹花中黃酮含量是有一定限度的，料液比達到1：30 時黃酮基本完全溶出，此時再增加溶劑的用量，提取率的變化不大。因此，料液比選擇1：30。

圖2 料液比對黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of material-liquid ratio on the extraction rate of flavonoids

2.3.3 超聲時間對牡丹花黃酮提取率的影響

圖3 顯示的是超聲時間對提取液中黃酮含量的影響。由圖可知，隨著提取時間的延長，黃酮的提取率逐漸增加，在40 min 時達到最高，之后提取時間再延長，黃酮的提取率呈現逐漸下降趨勢。原因是當提取時間過短時，牡丹花黃酮提取的不夠充分，沒有完全溶出，而時間過長，牡丹花中其他能溶解到乙醇中的化合物也可能被提取出來，從而影響黃酮和鋁離子的絡合，使吸光度下降。因此，提取時間選擇40 min。

圖3 提取時間對黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction rate of flavonoids

2.3.4 超聲溫度對牡丹花黃酮提取率的影響

圖4 顯示了超聲溫度對提取液中黃酮含量的影響，由圖可以看出，隨著提取溫度的升高，黃酮的提取率逐漸增加，但當溫度上升到60 ℃時，黃酮的提取率最高，再升高溫度，黃酮的提取率反而下降。原因是溫度過高時可能會導致一部分黃酮發生氧化而分解；同時，會有部分溶劑揮發損失，影響到料液比，從而使提取率降低。因此，提取溫度選擇60 ℃。

圖4 提取溫度對黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction rate of flavonoids

2.4 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，進行正交試驗，結果見表3，方差分析結果見表4。

從表3 中極差分析的結果可以看出，四個因素對牡丹花黃酮提取率的影響順序依次為乙醇濃度料液比＞提取時間＞提取溫度；提取黃酮的最佳條件是A1B2C2D3，即乙醇濃度50%、提取溫度60 ℃、提取時間40 min、料液比1：40。經驗證試驗，該條件下得到的牡丹花黃酮提取率為2.998%，均高于其他試驗組。從表4 顯著性分析中可以看出FD＞FC＞FB＞FA，且FD遠遠超過了F 臨界值，這表明料液比對提取率有顯著性影響，因此采用超聲波輔助提取牡丹花黃酮時應特別注意料液比。

3 結論

本文采用超聲波輔助提取法提取牡丹花黃酮，優化了提取工藝，確定了牡丹黃酮的最佳提取條件，并在此基礎上研究了牡丹黃酮的含量及抗氧化性能。與傳統浸提法相比，超聲波輔助提取方法具有省時、提取率高、設備簡單等優點。

表3 正交試驗結果Table 3 Orthogonal test results

表4 正交試驗方差分析Table 4 The variance analysis of orthogonal test

試驗還得到，影響牡丹黃酮的提取效果因素的大小順序為料液比＞提取時間＞提取溫度＞提取溶劑濃度。最佳提取工藝為乙醇濃度50%、提取溫度60 ℃、提取時間40 min、料液比1：40。在最佳提取條件下，牡丹花中總黃酮提取率為2.998%。