地爾硫卓對異丙腎上腺素誘導的大鼠心肌纖維化的保護作用研究

范麗 姚亞妮 李瑜

心肌纖維化會引起心臟心室壁增厚，誘發心肌重構最終導致心力衰竭，主要表現為細胞外基質過度沉積和膠原比例失調且排列紊亂[1]。異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)作為β-腎上腺素能受體的激動劑，通過介導兒茶酚胺的自氧化產生高細胞毒性的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，導致心臟功能紊亂[2]。

地爾硫卓通過結合細胞膜上的鈣通道蛋白來抑制鈣離子內流，能夠有效緩解心絞痛、心力衰竭和動脈粥樣硬化等心血管疾病[3-4]。尚未有研究報道其對心肌纖維化的保護作用。本研究旨在評價地爾硫卓對大鼠心功能、血流動力學以及組織形態學和膠原沉積的影響，從抗氧化和抑制核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)通路兩方面探討地爾硫卓對異丙腎上腺素誘導的大鼠心肌纖維化發揮保護作用的機制。

材料與方法

1.實驗材料 (1)試劑：地爾硫卓購買自天津田邊制藥有限公司(國藥準字H12020126，1506042)。異丙腎上腺素購買自Sigma公司。戊巴比妥鈉購買自北京化學試劑公司。HE染色試劑盒購買自武漢博士得生物工程有限公司。Masson試劑盒，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)和丙二醛(malonaldehyde，MDA)檢測試劑盒購買自南京建成生物工程研究所。Collagen I和Collagen III抗體購買自北京博奧森公司，S-P免疫組化試劑盒購買自北京中衫金橋生物技術有限公司。NF-κB、轉錄生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)以及GAPDH等單克隆抗體均購買自Cell signal公司，山羊抗兔HRP-IgG購買自Santa Cruz公司。BCA蛋白測定試劑盒購買自北京索萊寶生物科技有限公司，超敏ECL化學試劑盒購買自上海西唐生物科技有限公司。

(2)實驗動物：SPF級，雄性，Sprague-Dawley大鼠，30只，6周齡，體質量220～260 g，由新疆醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產合格證號：65000700000045。動物飼養環境SPF級，分籠飼養，可自由獲取水和食物，12 h交替照明，室溫保持在(22±1)℃，濕度45%～65%，整個動物實驗過程嚴格遵照“Guide for the care and use of laboratory animals from the national institutes of health”[5]。

2.方法 (1)動物分組及給藥：30只大鼠適應性喂養1周后，隨機分為正常對照組、模型組和地爾硫卓組。除正常對照組，其他兩組均采用皮下注射異丙腎素的方法構建心肌纖維化模型，2 mg·kg-1·d-1連續注射10d[6]。地爾硫卓組以灌胃的方法給予10 mg·kg-1·d-1地爾硫卓。正常對照組和模型組的大鼠灌胃給予等量0.9%氯化鈉溶液，連續給藥4周。

(2)心電圖和血流動力學檢測：體表心電圖的檢測判斷大鼠心功能。大鼠腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，取仰臥位固定于恒溫鼠板上，用四肢電極分別插入大鼠肢端皮下，在用心電圖電極固定在雙上肢(右上肢紅色、左上肢黃色)和雙下肢(左下肢綠色、右下肢黑色)，使用RM6240生理信號采集處理系統記錄標準II導聯心電圖。

左心室插管術檢測血流動力學指標[7]。暴露頸動脈，結扎心臟遠端，用動脈夾夾住近心端，血管下穿線備用，動脈壁上行一斜切口，將充滿肝素0.9%氯化鈉溶液的動脈插管由切口向心臟方向插入動脈。松開動脈夾，推進動脈插管并扎緊，5～10 min后記錄麻醉狀態下血流動力學指標。

(3)HE染色和Masson染色及S-P免疫組織化學法：HE染色：待大鼠麻醉后腹主動脈取血，快速取出心臟組織，經0.9%氯化鈉溶液沖洗后，分離出心臟左心室上部組織，4%多聚甲醛固定24 h。乙醇逐級脫水，二甲苯、石蠟處理，包埋并制成4 μm厚的切片。二甲苯脫蠟，梯度乙醇復水，蘇木精-伊紅染色后，進行乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后進行鏡下拍照并觀察心肌形態變化。

Masson染色：取心臟左心室上部組織制成石蠟切片，預熱經常規石蠟脫水后行雙蒸水洗滌。首先滴加Masson復合染色液染色5 min后，0.2%乙酸溶液清洗30 s，滴加10%磷鎢酸分化8 min，0.2%乙酸溶液清洗3次。加苯胺藍染色5 min后再次用0.2%乙酸溶液清洗3次。最后經乙醇逐級脫水后，使用二甲苯透明，中性樹膠封片。待片子干燥后，鏡下拍照并觀察大鼠心臟組織膠原沉積的變化，膠原纖維呈藍色，胞質、心肌細胞呈紅色。計算心肌膠原容積分數CVF(%)＝心肌膠原面積/所測視野面積×100%。

S-P免疫組化法：左心室肌組織標本固定和石蠟包埋同HE和Masson染色，經脫蠟、水化、煮沸法修復，按照 S-P免疫組化試劑盒說明書操作。Collagen I和Collagen III的一抗分別以1∶400和1∶600的比例稀釋。顯微鏡下拍照并隨機選取五個視野。用Image-Pro plus 6.0計算Collagen I和Collagen III陽性面積。

(4)心肌組織中SOD、GSH-Px、MDA水平的檢測：取各組心肌組織，加入pH7.2 PBS勻漿稀釋成1%的組織勻漿，離心后收集上清以檢測心肌組織中SOD、GSH-Px、MDA等氧化應激標志物的含量。測定按照SOD、GSH-Px、MDA試劑盒說明書進行。

(5)心肌組織中 NF-κB、TGF-β1、CTGF 等蛋白表達水平的檢測：蛋白免疫印跡法檢測各組大鼠心肌組織中 NF-κB、TGF-β1、CTGF 等蛋白的表達水平。取各組大鼠心肌組織各100 mg，剪碎后加入裂解液和 PMSF，冰上勻漿后裂解 30 min。4℃，12 000 r/min離心10 min，取上清，BCA定量待測樣品總蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳后，濕轉法將蛋白條帶轉移到PVDF膜上。5%BSA室溫封閉2 h，TBST 洗膜。 加入 NF-κB、TGF-β1、CTGF 的單克隆抗體，4℃搖床孵育過夜，TBST清洗。加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗，室溫下振蕩孵育1 h，TBST清洗。滴加ECL超敏顯色液顯色后采用凝膠成像儀曝光，運用Image J獲得灰度值。

3.統計學方法 通過SPSS22.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差表示，通過One-Way ANOVA單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.地爾硫卓對心電圖和血流動力學指數的影響正常對照組的心電圖模式正常如圖1 A所示。而模型組的心電圖S-T段和T波的振幅明顯升高，QRS波的峰值衰減如圖1B所示(P＜0.05)。地爾硫卓組心電圖如圖1C所示，QRS波的峰值和且S-T段和T波的振幅有所恢復，說明地爾硫卓能逆轉因異丙腎上腺素引起的心功能障礙(P＜0.05)。

血流動力學結果顯示，與正常對照組相比，模型組的HR和LEVDP顯著升高，而LVSP和±dp/dt max顯著降低(P＜0.05)。地爾硫卓組的 HR、LVEDP顯著低于模型組，而LVSP和±dp/dt max明顯高于模型組，差異具有統計學意義(P＜0.05)。

圖1 各組大鼠的ECG檢測結果波形代表圖 A：正常對照組；B：模型組；C：地爾硫卓組

表1 三組大鼠的血流動力學檢測結果(±s)

表1 三組大鼠的血流動力學檢測結果(±s)

注：與正常對照組相比較，?P＜0.05；與模型組相比較，#P＜0.05

項目 正常對照組 模型組 地爾硫卓組LVSP/mmHg 141.39±1.88 109.84±6.47? 127.43±7.26#LVEDP/mmHg 6.01±0.34 11.45±0.18? 7.59±0.32#+dp/dt max/(mmHg/s) 13 832±56.73 10 057±81.64? 12 733±68.75#-dp/dt max/(mmHg/s)-5 792.12±39.74 -11 893±92.12? -7 138±59.37#HR/(Beats/min) 308.14±5.27 395.49±4.81? 324.63±4.95#

2.HE染色、Masson染色和免疫組化法 HE染色觀察地爾硫卓對心肌組織病理改變的影響。結果顯示，正常對照組心肌細胞形態結構清楚且排列規則。模型組心肌細胞間質增加，細胞斷裂且排列紊亂，橫紋肌消失，炎性細胞增多，伴有出血壞死。地爾硫卓組心肌排列紊亂和出血壞死程度明顯改善，出現極少量炎性細胞浸潤。

圖2 地爾硫卓對心肌組織形態學和膠原纖維沉積的影響 A：各組大鼠心肌組織的HE染色，Masson染色以及Collagen I和Collagen III的免疫組織化學代表圖(×200)。B：各組大鼠心肌組織中的膠原容積分數，Collagen I和Collagen III陽性率的結果統計圖。注：與正常對照組相比較，?P＜0.05；與模型組相比較，#P＜0.05

Masson染色結果中，正常對照組心肌間質可見少量正常纖維化。模型組可見大量藍色的膠原纖維(P＜0.05)，其膠原容積分數(CVF)較正常對照組顯著增加(P＜0.05)。地爾硫卓組有部分間質可見纖維化，有少量膠原纖維沉積，其CVF顯著低于模型組(P＜0.05)。

免疫組織化學結果顯示，模型組Collagen I和Collagen III的陽性面積率顯著高于正常對照組(P＜0.05)。地爾硫卓組Collagen I和Collagen III的陽性面積率顯著低于模型組(P＜0.05)。

3.地爾硫卓抑制ISO誘導的氧化應激反應 為了探究地爾硫卓保護心肌纖維化的作用機制，檢測了SOD、GSH-Px和 MDA等指標，見表2。結果發現，模型組SOD、GSH-Px含量顯著低于正常對照組(P＜0.05)，MDA 顯著高于正常對照組(P＜0.05)。與模型組相比較，地爾硫卓組的SOD、GSH-Px含量顯著增加(P＜0.05)，而 MDA含量顯著降低(P＜0.05)。

表2 地爾硫卓對SOD、GSH-Px、MDA等含量的影響(±s)

表2 地爾硫卓對SOD、GSH-Px、MDA等含量的影響(±s)

注：與正常對照組相比較，?P＜0.05；與模型組相比較，#P＜0.05

類別 正常對照組 模型組 地爾硫卓組SOD/(U/mg prot) 12.97±2.31 6.35±1.84? 10.62±2.19#GSH-Px/(mg·mL-1) 4.89±0.18 2.21±0.24? 3.81±0.19#MDA/(U/mg prot) 6.58±0.72 13.47±1.13? 8.25±0.84#

4.心肌組織中 NF-κB、TGF-β1、CTGF 等蛋白的表達水平檢測 進一步檢測各組大鼠心肌組織中NF-κB、TGF-β1、CTGF 等涉及心肌纖維化分子機制的蛋白的表達水平，來探討地爾硫卓發揮保護作用的機制。 與正常組相比，模型組中 NF-κB、TGF-β1、CTGF等蛋白的表達水平顯著增加(P＜0.05)。與模型組相比，地爾硫卓組中 NF-κB、TGF-β1、CTGF等蛋白的表達水平顯著降低(P＜0.05)，見圖3。

圖3 地爾硫卓對大鼠心肌組織中NF-κB、TGF-β1、CTGF蛋白表達水平的影響 A：蛋白免疫印跡結果圖。B：各組大鼠心肌組織中NF-κB、TGF-β1、CTGF等蛋白的表達水平的統計圖。注：與正常對照組相比較，?P＜0.05；與模型組相比較，#P＜0.05

討 論

心肌纖維化是一個復雜的病理過程，廣泛存在于各類心血管疾病的發生發展過程中，如心律失常、心力衰竭及心肌肥厚等[8]。大劑量的ISO通過自身氧化而誘導大量自由基的生成和聚集，從而引起膜通透性的變化，進一步引起膠原沉積和心肌纖維化，使心肌舒張和收縮功能受到抑制[9]。本實驗通過異丙腎上腺素建立心肌纖維化大鼠模型，探討地爾硫卓對心肌纖維化的保護作用及其作用機制。

心電圖和血流動力學檢測是評價藥物對心血管功能影響的一種常用方法[10]。心電圖結果發現，地爾硫卓能抑制異丙腎上腺素引起的QRS波的峰值和S-T段以及T波的改變，這提示地爾硫卓能改善心肌纖維化大鼠的心功能。臨床上常用LVEDP表示心臟的容量負荷，間接反應舒張功能，其升高會導致心肌細胞內線粒體數目增加，增加了心肌細胞耗氧量，使得膠原纖維合成增加[11]。LVSP和+dp/dt max反映心臟收縮功能[12]。其中LVSP代表等容收縮期左心室內壓力的變化，而+dp/dt max反應室壁肌張力上升的變化速率。-dp/dt max是評價心肌舒張功能的客觀指標，反映左心室的充盈程度和舒張功能及順應性。血流動力學檢測結果發現，模型組HR、LVEDP升高，而LVSP和±dp/dt max降低說明ISO誘導使得大鼠心肌收縮和舒張功能降低。而地爾硫卓組的HR和LVEDP顯著低于模型組，同時LVSP、±dp/dt max等上升。說明地爾硫卓能改善ISO引起的左心室收縮和舒張功能不全。

心肌纖維化即心肌纖維膠原網的重構，可通過Masson染色和免疫組化判斷心肌纖維化和膠原沉積情況。有研究表明，Collagen I和III是心肌膠原基質的主要結構蛋白，其含量是反映心臟舒張功能的客觀指標[13]。An等[14]發現I、III型膠原蛋白的表達量的增加誘導心肌纖維化的發生，阿托品的干預可以通過降低I、III型膠原蛋白的含量改善心肌纖維化的嚴重程度。本研究通過HE和Masson染色發現，地爾硫卓能顯著改善ISO引起的心肌結構紊亂和間質纖維化沉積現象。免疫組化檢測結果顯示，Collagen I和Collagen III的表達能被地爾硫卓顯著下調。

SOD、GSH-Px等內源性抗氧化酶是體內維持氧化/抗氧化平衡和清除自由基的首要物質[15]。氧化應激主要由ROS介導，能夠造成機體SOD、GSH-Px等抗氧化物質被大量消耗，進而引起生物膜中脂質成分發生氧化并產生MDA[16]。本研究結果顯示，ISO誘導后，大鼠氧化應激反應增強，心肌細胞合成的抗氧化酶減少，無法清除心肌細胞內積聚的自由基，加劇心肌纖維化的進程。地爾硫卓可通過增加大鼠心肌中SOD、GSH-Px含量，減少MDA的合成，對心肌纖維化產生抑制作用。

為了進一步探討地爾硫卓改善心肌纖維化的分子機制，通過免疫印跡法檢測了心肌組織中與促纖維化相關的相關蛋白 NF-κB、TGF-β1和CTGF等蛋白的表達情況。NF-κB信號通路是調節纖維化反應的經典通路，其下游蛋白TGF-β1是關鍵的致纖維化因子，促進心臟成纖維細胞增殖和活化成肌成纖維細胞，進而上調I型和III型膠原蛋白表達[17-18]。有研究指出，TGF-β1的表達可以促進主動脈狹窄患者的心肌纖維化進程[19]。CTGF因具有明顯的絲裂原性和趨化性，能誘導成纖維細胞增殖，是發生心肌纖維化的重要因子[20]。免疫印跡結果顯示，模型組NF-κB、TGF-β1 和 CTGF 的表達顯著高于正常對照組，提示心肌纖維化與NF-κB信號通路的激活有關。與模型組相比，地爾硫卓組的 NF-κB TGF-β1和CTGF等蛋白的表達顯著降低，提示地爾硫卓介導NF-κB信號通路抑制心肌纖維化。

有研究認為ISO引起的心肌纖維化損傷與Ca2+超載和ROS產生有關。ROS的過度生成通過激活NF-κB通路來誘發促炎反應和細胞凋亡的發生[21]。TGF-β和CTGF是NF-κB的下游促纖維化的蛋白，其表達上調可引起細胞外基質的過度沉積，引起心肌纖維化[21-22]。地爾硫卓一方面通過抗氧化應激來抑制NF-κB信號通路，另外一方面通過直接作用于NF-κB，從而引起下游的 CTGF下調，CTGF的下調介導了Collagen I和Collagen III的下調，即抑制了心肌纖維化的發生。綜上所述，地爾硫卓能改善心肌纖維化大鼠的心功能和血流動力學，減少心肌結構損傷和膠原沉積情況，其作用的發揮與抗氧化應激和抑制NF-κB信號通路有關。