鐵皮石斛組織培養(yǎng)研究

楊慧仙

(山西沃成生態(tài)環(huán)境研究所，山西 太原 030006)

鐵皮石斛，蘭科石斛屬，為多年生草本植物(附生)，最適生長(zhǎng)環(huán)境具有濕潤(rùn)、涼爽、空氣暢通的特點(diǎn)，主要生長(zhǎng)于海拔1 600 m的山地半陰濕的巖石上，喜溫暖濕潤(rùn)氣候和半陰半陽(yáng)的環(huán)境，不耐寒。鐵皮石斛是一種珍貴的中藥材，具有滋養(yǎng)陰津、促進(jìn)消化、提高免疫力，抗疲勞抗氧化，對(duì)腸胃病、咽喉疾病、糖尿病、心腦血管病等都有顯著療效[1]。但是鐵皮石斛因其本身的種質(zhì)特點(diǎn)(種子小而無胚乳)，于天然狀態(tài)下發(fā)芽率極低，而在與真菌共生時(shí)萌發(fā)率較高[2]，并且生長(zhǎng)發(fā)育緩慢。近年來，隨著自然環(huán)境的嚴(yán)重破壞、氣候變化和人為過度開采導(dǎo)致原生地鐵皮石斛已瀕臨滅絕。鐵皮石斛為享譽(yù)國(guó)際的“藥界大熊貓”，早在1987年就已成為三級(jí)保護(hù)植物(《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生藥材物種名錄》)，且于1992年作為瀕危植物，被錄入《中國(guó)植物紅皮書：稀有瀕危植物》[3]，目前，鐵皮石斛已成為世界自然保護(hù)聯(lián)盟認(rèn)定的極度瀕危植物[4]。植物組織培養(yǎng)技術(shù)是實(shí)現(xiàn)植物快速繁殖，人工栽培最快的技術(shù)手段[5]。鑒于野生的鐵皮石斛非常稀少而且非常昂貴，不適合大眾消費(fèi)，因此，組織培養(yǎng)技術(shù)作為鐵皮石斛擴(kuò)繁的關(guān)鍵，已成為解決其資源短缺的最有效途徑。為了提高鐵皮石斛的繁殖系數(shù)，本文以幼嫩的鐵皮石斛帶節(jié)莖段為試驗(yàn)材料，探究不同激素濃度、配比及添加不同種類的植物營(yíng)養(yǎng)液對(duì)鐵皮石斛組織培養(yǎng)的影響，以期找到適合鐵皮石斛擴(kuò)繁的最佳培養(yǎng)基配方，以達(dá)快繁和工廠化育苗的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鐵皮石斛健壯實(shí)生苗由山西長(zhǎng)治易康園鐵皮石斛養(yǎng)殖基地提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的消毒 于生長(zhǎng)旺盛、無病害、粗壯的植株上剪取中間莖段(4～8 cm)，肥皂水洗凈后剝?nèi)デo表皮，流水沖洗1 h后放入超凈工作臺(tái)。依次進(jìn)行如下步驟：70%酒精消毒(30 s)，無菌水清洗(3次)，0.1%升汞浸泡(3 min，中間搖晃5次)；無菌水沖洗5次；無菌濾紙吸干帶芽莖段的表面水分，剪成1.5 cm左右小段后放入無菌培養(yǎng)皿中備用。

1.2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選 本試驗(yàn)選取6種誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)，調(diào)節(jié)pH為5.8～6.2。培養(yǎng)基配制如下：

(1)MS+6-BA0.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+蔗糖30g·L-1

(2)MS+6-BA0.5 mg·L-1+NAA1.0 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1

(3)MS+6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1

(4)MS+6-BA1.0 mg·L-1+NAA1.0 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1

(5)MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1

(6)MS+6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1

每種培養(yǎng)基接20瓶，每瓶接5個(gè)莖段。放入培養(yǎng)室(溫度25 ℃±2，光照12 h，光照強(qiáng)度為2 000 lx)，以45 d后外植體的生長(zhǎng)狀況作為結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)記錄。

1.2.3 繼代培養(yǎng)基的篩選 新芽長(zhǎng)成之后，剪成大小均一的帶芽莖段(1.5 cm左右)，轉(zhuǎn)接至繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)。本試驗(yàn)共設(shè)置了4種繼代培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH為5.8～6.2。培養(yǎng)基配制如下：

(1)MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+香蕉汁30 g·L-1+蔗糖30 g·L-1

(2)MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+香蕉汁30 g·L-1+ 活性炭1 g·L-1+蔗糖30 g·L-1

(3)MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+馬鈴薯汁100 g·L-1+蔗糖30 g·L-1

(4)MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+馬鈴薯汁100 g·L-1+ 活性炭1 g·L-1+蔗糖30 g·L-1

每個(gè)處理接20瓶，每瓶接5個(gè)莖段。放入培養(yǎng)室(溫度25 ℃±2，光照12 h，光照強(qiáng)度為2 000 lx)，觀察記錄，45 d后統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)狀況。

1.2.4 生根培養(yǎng)基的篩選 選取一定高度(>1.5 cm)且生長(zhǎng)健壯的幼苗，于生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)基的pH調(diào)至5.8～6.2。本試驗(yàn)生根培養(yǎng)基設(shè)五個(gè)處理，分別為：

(1)1/2MS+NAA0.1 mg·L-1+香蕉汁30 g·L-1+蔗糖30 g·L-1

(2)1/2MS+NAA0.2 mg·L-1+香蕉汁30 g·L-1+蔗糖30 g·L-1

(3)1/2MS+NAA0.3 mg·L-1+香蕉汁30 g·L-1+蔗糖30 g·L-1

(4)1/2MS+NAA0.4 mg·L-1+香蕉汁30 g·L-1+蔗糖30 g·L-1

(5)1/2MS+NAA0.5 mg·L-1+香蕉汁30 g·L-1+蔗糖30 g·L-1

每個(gè)處理接20瓶，每瓶接5個(gè)莖段。放入培養(yǎng)室(溫度25 ℃±2，光照12 h, 光照強(qiáng)度為2 000 lx)，觀察記錄生根情況，45 d后統(tǒng)計(jì)生根率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素處理對(duì)鐵皮石斛嫩莖誘導(dǎo)的影響

如表1所示，不同生長(zhǎng)激素的濃度及配比在誘導(dǎo)鐵皮石斛嫩莖的發(fā)生方面影響顯著。選擇0.5 mg·L-16-BA時(shí)，鐵皮石斛生長(zhǎng)緩慢，出芽少且部分苗形成愈傷組織。鐵皮石斛小苗隨6-BA濃度的升高而萌動(dòng)加快且出芽增多。研究發(fā)現(xiàn)，6-BA(1.5 mg·L-1)與NAA(0.5 mg·L-1)結(jié)合使用時(shí)誘導(dǎo)效果最好(誘導(dǎo)率達(dá)到97%)，且鐵皮石斛出芽最多、生長(zhǎng)茁壯。因此本試驗(yàn)中鐵皮石斛的嫩莖誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1。

表1 不同激素處理對(duì)鐵皮石斛嫩莖誘導(dǎo)的影響

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛繼代培養(yǎng)的影響

從表2可知：鐵皮石斛組培苗在加入活性炭的培養(yǎng)基中的長(zhǎng)勢(shì)整體比不加活性炭的好，且增殖系數(shù)較大；培養(yǎng)基中添加了30g/L香蕉汁的鐵皮石斛組培苗比添加了100 g·L-1馬鈴薯汁的出芽少，即增殖系數(shù)較小，但苗長(zhǎng)得較壯；而在添加了馬鈴薯汁的培養(yǎng)基中出芽多即增殖系數(shù)大，但是苗細(xì)長(zhǎng)、葉窄。試驗(yàn)結(jié)果表明，香蕉汁的壯苗效果優(yōu)于馬鈴薯汁，而馬鈴薯汁的增殖效果明顯好于香蕉汁。因此，在對(duì)鐵皮石斛進(jìn)行繼代培養(yǎng)時(shí)，前期可以用培養(yǎng)基MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+馬鈴薯汁100 g·L-1+ 活性炭1 g·L-1+蔗糖30 g·L-1，獲得較多的芽，后期將長(zhǎng)勢(shì)較弱的苗轉(zhuǎn)接入培養(yǎng)基MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+香蕉汁30 g·L-1+ 活性炭1 g·L-1+蔗糖30 g·L-1，使苗長(zhǎng)得更粗壯。

表2 不同培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛繼代培養(yǎng)的影響

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛生根培養(yǎng)的影響

在生根培養(yǎng)基中，不同濃度的NAA對(duì)鐵皮石斛根的誘導(dǎo)效果明顯。如表3所示，鐵皮石斛生根率隨NAA濃度的升高，呈現(xiàn)出先升后降的變化趨勢(shì)。0.3 mg·L-1NAA處理時(shí)，鐵皮石斛的生根率最高(達(dá)到94%)，且此時(shí)培養(yǎng)基中的組培苗長(zhǎng)勢(shì)良好(莖粗壯、主根長(zhǎng)而粗、側(cè)根多而壯)。這可能是因?yàn)榈蜐舛鹊腘AA，促進(jìn)鐵皮石斛的生根，高濃度的NAA，抑制鐵皮石斛生根。因此，本試驗(yàn)中最適合鐵皮石斛生根的培養(yǎng)基為：1/2MS+NAA0.3 mg·L-1+香蕉汁30 g·L-1+蔗糖30 g·L-1。

表3 不同培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛繼代培養(yǎng)的影響

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，鐵皮石斛嫩莖的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1。繼代培養(yǎng)基可以用MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+馬鈴薯汁100 g·L-1+ 活性炭1 g·L-1+蔗糖30 g·L-1，獲得較多的鐵皮石斛芽，再將獲得的芽轉(zhuǎn)接入MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1蕉汁30 g·L-1+活性炭1 g·L-1+蔗糖30 g·L-1，使鐵皮石斛苗長(zhǎng)得更粗壯。最佳的生根培養(yǎng)基是：1/2MS+NAA0.3 mg·L-1+香蕉汁30 g·L-1+蔗糖30 g·L-1。

本試驗(yàn)在培養(yǎng)基中加入了香蕉汁、馬鈴薯汁以及活性炭，這些物質(zhì)能夠?yàn)橥庵搀w提供一些必要的微量營(yíng)養(yǎng)成分、生理活性物質(zhì)和生長(zhǎng)激素等，對(duì)鐵皮石斛的增殖和分化有促進(jìn)作用。香蕉汁的壯苗效果優(yōu)于馬鈴薯汁，而馬鈴薯汁的增殖效果明顯好于香蕉汁，這和郜李彬等[6]人的研究結(jié)果一致。前人在鐵皮石斛培養(yǎng)的不同階段也曾加入了不同的天然提取液，得到的結(jié)果也不盡相同。這可能跟不同的研究人員選取的鐵皮石斛品種、外植體類型不同有關(guān)。因此要根據(jù)具體的品種、外植體類型等實(shí)際情況選擇鐵皮石斛組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方。