抗CMV轉基因辣椒實時熒光PCR檢測方法研究

羅阿東　王麗平　任艷玲　蔡秋　王艷

摘要針對辣椒中轉基因成分建立快速、高效、準確的實時熒光PCR檢測方法，以縮短檢測周期，提高檢出率。結果表明，針對轉基因辣椒的內源基因CaATLI和外源基因CMV建立的檢測方法，具有很好的特異性，二者檢測靈敏度均可達0.01%。本研究建立的檢測方法特異性、靈敏度和準確度高，也比較方便快速，同時使用的是全部閉管操作，大大降低了普通PCR帶來的污染，為轉基因辣椒的檢測提供了新的檢驗方法。

關鍵詞 轉基因辣椒;實時熒光PCR檢測方法;CaATLI基因;CMV基因

中圖分類號 S641.3

文獻標識碼 A

文章編號 1007-5739（2019）05-0067-03

辣椒是人們生活中必不可少的蔬菜作物，具有藥理、經濟、食用、營養等方面的價值。我國辣椒制品種類繁多，如油辣椒、糟辣椒、辣椒醬等，辣椒制品的多樣化推動了我國辣椒產業經濟的發展辣椒在世界各地廣泛種植，但同時也面臨著連作障礙、土壤傳播疫病、生長條件產量及質量等諸多問題，人們借助轉基因技術以及辣椒分子育種技術，對辣椒的生長條件、栽培技術、病蟲害防治等方面進行了研究。

隨著轉基因作物及其產品的大規模商業化，越來越多的轉基因農產品被制作成為人類消費的食品，轉基因食品在傳統食品市場中的份額正不斷加大，逐步走上餐桌，進入人們的食物鏈。由于其安全性及對人類健康和生態環境的潛在威脅受到國際社會和廣大民眾的廣泛關注B，作物轉基因成分的檢測越來越受到重視。

目前，對于轉基因成分檢測主要是針對重組DNA的核酸檢測，如聚合酶鏈式反應（PCR），包括定性PCR、多重PCR和實時熒光PCR等。其中，實時熒光PCR作為目前主要的檢測方法，有效避免了普通PCR方法存在的檢測靈敏度不高、費時且容易造成交叉污染等缺點，確保了檢測結果的快速、準確。

本文通過應用實時熒光PCR技術對抗CMV（Cucumber?mosaic?virus，黃瓜花葉病毒）轉基因辣椒進行檢測，旨在建立一種簡便、快速的辣椒轉基因成分檢測方法，以期為消費者食品安全及我國農業轉基因生物的監管提供有力的技術支持。

1材料與方法

1.1試驗材料與儀器

1.1.1材料。轉基因辣椒陽性標準物質，非轉基因辣椒，非轉基因玉米、大豆、水稻油菜籽、番茄。

1.1.2試劑。Premix?Ex Taq（Probeq?PCR）（熒光PCR反應液）、MiniBESTUniversalGenomicDNAExtractionKit（DNA提取試劑）、引物及TaqMan探針，均購買于寶日醫生物技術有限公司。

1.1.3儀器。實時熒光PCR儀（7500Fast，美國Applied?Bio-systems）、高速冷凍離心機（Microfuge22R?Centrifuge，美國Beckman Coulter）、超純水儀（Milli?Q，美國Millipore）核酸蛋白測定儀（Nano?Drop2000，美國Thermo?Scientific）、冷凍研磨儀（MM400，德國Retsch）、移液器、渦旋振蕩器恒溫金屬浴、生物安全柜等。

1.1.4引物及探針。根據GenBank中轉基因辣椒的CaATLI（Capsicumannum?AT-hooklgene，編碼辣椒AT一hook1蛋白基因）和CMV基因序列，利用Primer?Express軟件設計引物和TaqMan探針序列，弓物和探針序列及擴增長度見表1，探針和引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2試驗方法

1.2.1DNA提取。取2%CTAB抽提緩沖液于65C金屬浴中預熱，取樣品約0.3g置于冷凍研磨儀（液氮處理）研磨，加入2%CTAB抽提緩沖液700μL，輕輕攪動，將磨碎液倒人1.5mL滅菌離心管中，于65C金屬浴加熱振蕩10min，加人5mol/L醋酸鉀溶液5μL，混勻，再金屬浴20min;取出離心管后放置在冰上，加人等體積的氯仿/異戊醇（24：1），輕輕來回顛倒，充分混勻;然后放人4C高速冷凍離心機中（12000r/min）離心15min，吸取上清液500μL放入另一離心管中，加入等體積的異戊醇，顛倒混勻;12000r/min離心10min后，棄上清，加入75%乙醇500μL，輕彈離心管，使沉淀與管底的DNA塊狀物浮游于液體中，放置30min，使DNA塊狀物上的不純物溶解;12000r/min離心5min后棄去上清，加入等量75%乙醇再洗30min，12000r/min離心5min后，棄上清液，并將離心管倒立于濾紙之上，自然風干，加入50μLTE溶液，使DNA溶解，利用核酸蛋白測定儀測定樣品DNA的OD260與OD280，其余于-20C冰箱冷凍保存待用。1.2.2熒光PCR反應體系。實時熒光PCR使用商品化專用熒光PCR反應液PremixExTaqP（內含經優化過的Taq酶、Mg*、dNTP）;反應體系中的引物和TaqMan探t使用推薦濃度，具體見表2。

1.2.3熒光PCR反應程序。根據引物及TaqMan探針Tm值，確定熒光PCR反應的最佳反應程序，見表3。

1.2.4特異性試驗。以轉基因辣椒陽性標準品以及非轉基因辣椒、玉米、大豆、水稻、油菜籽、番茄的基因組DNA為模板，進行實時熒光PCR檢測，確定內源基因引物CaATLI和外源基因引物CMV的特異性。

1.2.5靈敏度試驗。測定轉基因辣椒陽性標準品DNA濃度，并對其進行10倍梯度稀釋，稀釋10個梯度，將稀釋液用上述反應體系和程序進行實時熒光PCR檢測，確定檢測靈敏度。

2結果與分析

2.1DNA提取結果

提取樣品總DNA，利用核酸蛋白測定儀測定樣品DNA的濃度與純度，DNA質量濃度可以達到100～200ng/uL，OD2x/OD280值在1.6～1.8之間，均達到后續試驗對DNA進行分析的要求。

2.2特異性試驗結果

以轉基因辣椒陽性標準品以及非轉基因辣椒、玉米、大豆、水稻油菜籽、番茄的基因組DNA為模板，進行實時熒光PCR檢測。

由圖1可知，針對內源基因CaATLI，只有轉基因辣椒陽性標準品和非轉基因辣椒有明顯擴增曲線，而其他對照物則無擴增曲線;針對外源基因CMV，只有轉基因辣椒陽性標準品有明顯擴增曲線，其余對照物則沒有。結果表明，針對內源基因CaATLI和外源基因CMV的檢測引物和探針具有較好的特異性。

2..3靈敏度試驗結果

測定陽性標準品DNA濃度為240ng/μL，并對其進行10倍梯度稀釋，用上述反應體系和程序進行實時熒光PCR檢測，確定檢測靈敏度。

由圖2可知，內源基因CaATLI和外源基因CMV到了10-5稀釋度（0.01%）仍然可以檢測出來，形成典型的“S"形擴增曲線。其中，內源基因CaATLI在106稀釋度有非典型的擴增曲線（CT值>35），在進行10次重復測試后，發現10-6稀釋度擴增曲線呈現不穩定態勢，表明該稀釋度下的DNA含量極低，已達到方法檢測極限，容易出現波動，故將其靈敏度取10-5稀釋度（0.01%）。

3結論與討論

在分子生物學的標準上，判斷DNA純度的依據是OD20/OD280的比值，符合要求純度高的純化DNA其0D260/OD20在1.7～1.9之間，低于此范圍表示所提取的樣品DNA中含有蛋白質污染，高于此范圍表明樣品DNA中有RNA.污染。提取的辣椒樣品DNA中存在著較多的多酚、多糖，也是導致0D26/OD280比值偏低的原因之一。因此，在操作的過程中，需要注意多糖、多酚雜質的去除。

特異性試驗結果表明，針對辣椒內源基因CaATLI和外源基因CMV的檢測引物和探針具有較好的特異性;靈敏度測試結果表明，轉基因辣椒實時熒光PCR的靈敏度小于0.01%。目前，國際上設定的轉基因限量大多為1%，是本方法檢測靈敏度的100倍，認為0.01%的檢測靈敏度已完全能夠滿足基因檢測的需要。

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