北部灣海綿Siphonochalina flexa共附生細菌多樣性及抑甘蔗鞭黑粉菌活性研究

江蕾 李蜜 李智 易湘茜 高程海 周桂

摘 ?要 ?分離純化廣西怪石灘海域海綿可培養(yǎng)共附生細菌，分析其多樣性并研究共附生細菌發(fā)酵產物對甘蔗鞭黑粉菌的抑制活性，為研發(fā)新型生物農藥提供參考依據。采用8種培養(yǎng)基分離純化海綿共附生細菌，運用16S rDNA測序方法進行菌種鑒定及多樣性分析，采用牛津杯法測試細菌發(fā)酵產物對甘蔗鞭黑粉菌的抑制效果。經形態(tài)學分析及16S rDNA比對，海綿中共獲得34株共附生細菌，隸屬于18科24屬。活性檢測結果表示，存在14株對甘蔗鞭黑粉菌有抑制效果的菌株。海綿中可培養(yǎng)共附生細菌物種多樣性豐富，部分菌株的發(fā)酵產物對甘蔗鞭黑粉菌具有較強的抑制效果，有成為新型生物農藥的潛力。

關鍵詞 ?海綿;共附生細菌;物種多樣性;甘蔗鞭黑粉菌;抑菌活性

中圖分類號 ?S566.1 ?????文獻標識碼 ?A

Abstract ?The purpose of this study was to investigate the distribution and the diversity of co-bacteria of Siphonochalina flexa isolated from Guaishi sea beach and to study its antifungal activities of the fermentation liquids against Sporisorium scitamineum. Eight different isolation media were used to isolate and purify the co-bacteria from S. flexa. The 16S rDNA was employed to explore the diversity of the isolated strains. The effects of the fermentation liqiuds against S. scitamineum were tested with the method of Oxford cup. After the morphological analysis and 16S rDNA alignment， 34 strains of co-bacteria were isolated from S. flexa， belonging to 18 families and 24 genera. Through testing the antifungal activities， we screened 14 kinds of bacteria that had the inhibitory effect on S. scitamineum. The cultivated bacteria in S. flexa were rich in species and most of them showed strong activity of against S. scitamineum.

Keywords ?Siphonochalina flexa; co-bacteria; species diversity; Sporisorium scitamineum; antifungal activities

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.07.025

甘蔗是廣西主要的經濟作物，也是該地區(qū)的支柱產業(yè)，但其產量往往受制于甘蔗黑穗病[1]。甘蔗鞭黑粉菌（Sporisorium scitamineum）是引起甘蔗黑穗病的主要原因，目前世界上對其防治主要集中在強化育種、加強檢疫和抗性基因研究，但這些對于遏制甘蔗黑穗病的發(fā)生都沒有很好的作用[2]。嘧菌酯、啶酰菌胺等化學農藥常被用于防治甘蔗黑穗病[3-4]。雖然化學農藥可用于防控甘蔗黑穗病，但會嚴重污染大氣和水環(huán)境，同時增強甘蔗鞭黑粉菌抗藥性。因此尋找防治甘蔗鞭黑粉菌的生物農藥，對蔗種消毒、宿根及枝葉防治，降低初次侵染率和減少孢子傳播，對甘蔗優(yōu)化種植、提高產量等有著重要意義。

生物防治作為植物病害防治的重要組成部分，越來越得到世界各國的重視并發(fā)揮著重要的作用[5]。廖詠梅等[6]從甘蔗根際土壤及其不同組織內分離出的928株菌中，篩選得到18株菌對甘蔗黑穗病菌有強拮抗作用，其中12株為芽孢桿菌。熊國如等[7]在海南蔗區(qū)甘蔗根際土壤微生物中篩選得到1種能抑制甘蔗黑穗病菌的菌株，并在盆栽試驗的防效表現也很好，該株細菌為枯草芽孢桿菌。李菲等[8]對分離自廣西北海金海灣紅樹植物秋茄中的50株內生細菌進行抑制甘蔗鞭黑粉菌的活性篩選，結果顯示有37株對甘蔗鞭黑粉菌有抑制活性。

廣西海域地處亞熱帶，蘊藏著豐富的海洋微生物資源[9]，但關于該海域海綿共附生細菌方面的研究報道較少，而利用菌株發(fā)酵產物抑制甘蔗鞭黑粉菌的海洋細菌更是鮮見。對廣西防城港怪石灘海域的海綿中可培養(yǎng)共附生細菌進行多樣性分析，并利用甘蔗鞭黑粉菌對細菌次級代謝產物進行活性的初步篩選，為該海域細菌資源的開發(fā)利用及研發(fā)生物類農藥奠定基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?海綿樣本來源、預處理及其共附生細菌的分離純化 ?海綿樣品于2016年10月采集自廣西防城港怪石灘（E 108°22， N 21°49）水下5 m，由廣西中醫(yī)藥大學高程海研究員鑒定為彎曲管指海綿（Siphonochalina flexa）。海綿表面用無菌水沖洗三遍，取1 cm1 cm新鮮海綿大約2 g加入1?mL無菌水研磨，研磨后液體保存于1.5 mL離心管中，待用。將研磨后液體作為樣品原液，依次稀釋到103濃度，取稀釋后102、103樣液0.2 mL，分別接種于M4、M5、M6、M7、M9、2216E、Gause No. 1、AGG這8種不同分離培養(yǎng)基中培養(yǎng)基配方如表1所示（所有培養(yǎng)基需加入復合鹽溶液10 mL，瓊脂20 g，并調節(jié)pH 7.2，于115?℃滅菌30 min，待溫度降到55?℃時加入0.5 mL 25 mg/L的重鉻酸鉀以抑制真菌生長），28?℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)15 d，通過形態(tài)觀察挑選菌落，記錄菌落形態(tài)特征及數量，并挑選形態(tài)各異的菌落進行劃線純化。純化后的菌株制成凍干牛奶管于4?℃低溫保藏，同時制成20%甘油管于80?℃冷凍保藏。

1.1.2 ?供試菌采集及保存 ?甘蔗鞭黑粉菌冬孢子于2017年5月采自廣西金光農場，采集新鮮甘蔗黑鞭（冬孢子），輕輕敲打黑鞭，將冬孢子裝于封口袋中，4?℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 ?共附生細菌16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析

采用Chelex-100法[10]提取菌種的DNA，參照Walsh等[11]的方法進行PCR擴增。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像儀檢驗條帶，合格樣品測序委托上海美吉生物醫(yī)藥技術有限公司廣州分公司進行。測序結果經DNA Star軟件整理，利用EzTaxon服務器（http：//www.eztaxon.org/）[12]及Blast網站進行在線比對;選取高同源性序列作為參比對象，運用MEGA5.0軟件，Neighbor- Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹并分析各菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位[13]。

1.3 ?共附生細菌對甘蔗鞭黑粉菌的抑制實驗

1.3.1 ?細菌粗提物的制備 ?參照覃媚等[14]的方法，將34株處于對數生長期的細菌接種發(fā)酵7 d，破壁處理后萃取濃縮得到細菌粗提物，并置于干燥器低溫保存。

1.3.2 ?甘蔗鞭黑粉菌擔孢子與菌絲的制備 ?參照Singh等[15]和朱桂寧等[3]的方法，取少量（綠豆大小）冬孢子與10 mL無菌水混勻，稀釋涂布多個濃度梯度，觀察其萌發(fā)狀況，經過試驗發(fā)現103濃度萌發(fā)最佳。用接種環(huán)挑取適量（芝麻大小）萌發(fā)后冬孢子與1 mL無菌水混勻，稀釋涂布多個梯度，經試驗驗證105濃度最佳，取200 μL 105濃度液涂布于PDA培養(yǎng)基，于28?℃培養(yǎng)3～5 d，觀察其生長狀況，孢子萌發(fā)過程中未發(fā)現有細菌滋生。選取5～7個酵母形態(tài)菌落，分別接種于YEPS液體培養(yǎng)基中，180 r/min，28?℃培養(yǎng)2 d，取少量菌液于PDA培養(yǎng)基上進行交叉配型，運用排列組合方式兩兩交叉培養(yǎng)，菌落為白色絨毛狀，則兩菌株為異型（+、）交配型單倍體擔孢子。若菌落為酵母形態(tài)，則兩菌株為同型（+、+或、）交配型單倍體擔孢子[3]。

1.3.3 ?抑制甘蔗鞭黑粉菌擔孢子及菌絲生長活性鑒定 ?（1）待試菌板的制備：分別挑取2種異型擔孢子接種于50 mL YEPS液體培養(yǎng)基，于28?℃、180 r/min的搖床中培育36～48 h。參照李菲等[8]的方法制備待試菌板。

（2）抑菌活性測定：采用牛津杯法[16]檢測34株細菌抑制甘蔗鞭黑粉菌活性。用一定量生物級DMSO溶解配制細菌粗提物樣品，粗提物樣品濃度為10 mg/mL，再用一次性過濾器過濾樣品。空白對照為DMSO溶劑，陽性對照為5 μg/mL啶酰菌胺溶液。每個牛津杯加入藥液100 μL，置于28?℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d后，利用垂直十字交叉法測量各抑菌圈的直徑。

2 ?結果與分析

2.1 ?海綿中可培養(yǎng)共附生細菌多樣性分析

本研究采用8種分離培養(yǎng)基，從海綿中分離到48株共附生細菌，根據菌落的大小、形態(tài)、顏色和出現時間等特征進行排重。大部分菌株呈現淺色系、白色、淺紅色和淺黃色等，少數為黃褐色、棕褐色和橘黃色，多出現于3～4 d，直徑大小主要集中在1～6 mm。經過形態(tài)特征與16S rDNA排除重復后得到34株菌株，其形態(tài)特征詳情如表2所示。獲得34株共附生細菌，隸屬于4門18科24屬，詳情見表3。其中，菌株BGMRC03076 Gordonia bronchialis相似度為97%，極有可能為潛在新種。根據共附生菌株與相似菌株的16S

2.2 ?海綿中細菌發(fā)酵產物抑制甘蔗鞭黑粉菌的活性分析

34株細菌的發(fā)酵代謝產物經抑制甘蔗鞭黑粉菌的活性篩選，結果顯示存在10株細菌具有抑制鞭黑粉菌菌絲生長活性，6株細菌能抑制鞭黑粉菌“+”擔孢子，7株細菌能抑制鞭黑粉菌“”型擔孢子，部分抑菌結果如圖（圖2A，圖2B，圖2C）。其中，有2株同時具有抑制3種甘蔗鞭黑粉菌形態(tài)的活性（表4）。陽性對照組（5?μg/mL啶酰菌胺溶液100?μL）出現明顯抑菌圈，抑菌圈直徑為（23.0±2.0） mm，陰性對照組未出現抑菌圈。活性菌株中分別包含12個屬，放線菌屬（Acineto bacter）2株，分枝桿菌屬（Mycobacterium）2株，節(jié)細菌屬（Arthr obacter），芽孢桿菌屬（Bacillus），檸檬酸桿菌屬（Citr obacter），埃希氏桿菌屬（Escherichia），戈登氏菌屬（Gordonia），細桿菌屬（Microb acterium），小單孢菌屬（Micro monos po ra），根瘤菌屬（Rhiz obium），紅球菌屬（Rhodo coc cus），Sphingopyxis菌屬分別1株。其中菌株BGM RC03066芽孢桿菌屬的Bacillus siamensis對“+”擔孢子的抑制活性最強，抑菌圈直徑達到（25.40±0.85）mm，和陽性組比較具有顯著抑制活性。

3 ?討論

海綿生活在海洋環(huán)境，常常與共附生微生物共同生存，以互惠互利或一方受益的方式共生、寄生或共棲[17]。李菲等[8]、王偉[17]與劉歡等[18]先后報道了關于海綿共附生細菌多樣性的研究進展。目前，關于海綿的研究偏重于自身[19]與其共附生真菌代謝產物[20]的化學成分及活性研究，針對其共附生細菌的多樣性及發(fā)酵產物的活性研究較少。

本研究選擇廣西防城港怪石灘海域的海綿進行其共附生細菌多樣性分析。采用8種不同的分離培養(yǎng)基分離純化海綿中的共附生細菌，分離培養(yǎng)共附生細菌34株，隸屬于18科24屬。采用牛津杯法測定34株共附生細菌對甘蔗鞭黑粉菌的抑制活性，結果顯示，14株細菌具有良好的抑菌活性，總陽性率為41.2%。其中，BGMRC03066與BGMRC03081對甘蔗鞭黑粉菌菌絲及擔孢子（+、）都有不同程度的抑制作用，且抑制效果較好。BGMRC03066與BGMRC03081分別隸屬芽孢桿菌屬和微桿菌屬，其中尤以芽孢桿菌屬的抑菌效果最好，此結果與李菲等[8]和廖詠梅等[6]的結果相似。由此可見芽孢桿菌屬具有較強的抑菌活性，下一步將對抑菌活性較好的菌株進行發(fā)酵條件的優(yōu)化，并分析其發(fā)酵代謝產物的化學組成及其抑菌機理，以期為新型生物農藥的開發(fā)與利用奠定基礎。

廣西防城港海域海洋生物多樣化，海洋生物蘊藏著豐富的細菌資源，且活性菌株較多，因此從海綿共附生細菌中尋找具有抗農業(yè)病原真菌的活性菌株，利用海洋可再生資源解決農業(yè)實際問題可成為新的研究方向。

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