超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定植物源調(diào)味料中氯蟲苯甲酰胺殘留

錢兵 趙婧 何燕 韓丙軍 彭黎旭 王文斌

摘 ?要 ?本研究建立了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）測定植物源調(diào)味料中氯蟲苯甲酰胺殘留量的分析方法。調(diào)味料樣品經(jīng)改進(jìn)后的QuEChERS方法前處理，選擇C18超高效液相色譜柱進(jìn)行分離，采用電噴霧離子源正離子模式、多反應(yīng)監(jiān)測方式進(jìn)行采集，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，方法在0.005～0.200 ?g/mL范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)均優(yōu)于0.999，加標(biāo)回收率在70%～108%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.9%～10%之間。方法檢出限為0.002 mg/kg，定量限為0.005 mg/kg。該方法操作簡便快速、靈敏、準(zhǔn)確性高，適用于植物源調(diào)味料中氯蟲苯甲酰胺的殘留量檢測。

關(guān)鍵詞 ?超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;植物源調(diào)味料;氯蟲苯甲酰胺

中圖分類號(hào) ?X839.2 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A

Abstract ?A simple and efficient method based on ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） detection was developed to analyze the residue of chlorantraniliprole in plant-derived condiment. The condiment samples were pretreated with a modified QuEChERS method， and separated on an UPLC C18 column. The analyses of chlorantraniliprole were operated with electrospray ionization mass spectrometry under positive mode using a multiple reaction monitoring mode， and then quantitatived by an external standard method. The results showed that the correlation coefficients of the calibration curves were over 0.999 in linear range of 0.005–0.200 ?g/mL. The average recoveries at three spiked concentration levels varied from 70% to 108% with relative standard deviations （RSDs） of 1.9%–10%. The limits of detection （LOD） and quantitation （LOQ） was 0.002 mg/kg and 0.005 mg/kg， respectively. In conclusion， this simple and efficient method meet the method validation requirements for the determination of chlorantraniliprole residues in plant-derived condiment.

Keywords ?UPLC-MS/MS; plant-derived condiment; chlorantraniliprole

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.07.030

氯蟲苯甲酰胺（chlorantraniliprole）是一種高效、低毒、廣譜的新型殺蟲劑[1]，主要作用方式為胃毒作用和觸殺作用，結(jié)構(gòu)式見圖1。其作用機(jī)理為激活蘭尼堿受體，釋放平滑肌和橫紋肌細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的鈣，從而引起肌肉調(diào)節(jié)衰弱、麻痹，最終導(dǎo)致害蟲死亡[2]，被廣泛用于鱗翅目害蟲[3]。近年來被廣泛使用于蔬菜、水果和糧食作物上的蟲害防治[4-5]。

圖1 ?氯蟲苯甲酰胺化學(xué)結(jié)構(gòu)式

Fig. 1 ?Structure formula of chlorantraniliprole

隨著氯蟲苯甲酰胺在不同農(nóng)作物生產(chǎn)中廣泛使用，其在農(nóng)產(chǎn)品及食品中可能引起的殘留風(fēng)險(xiǎn)受到人們的廣泛關(guān)注。我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) ?食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763-2016）規(guī)定了氯蟲苯甲酰胺在谷物、油料和油脂、蔬菜、水果、堅(jiān)果、糖料及調(diào)味料等不同農(nóng)產(chǎn)品及食品中的殘留限量。但是，由于我國尚未制定氯蟲苯甲酰胺在農(nóng)產(chǎn)品中殘留檢測方法標(biāo)準(zhǔn)，目前國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763-2016規(guī)定的氯蟲苯甲酰胺殘留限量為臨時(shí)限量。因此，迫切需要建立氯蟲苯甲酰胺在不同農(nóng)產(chǎn)品及食品中的殘留檢測方法，為氯蟲苯甲酰胺的監(jiān)管提供技術(shù)支持。

目前，氯蟲苯甲酰胺的檢測分析方法主要使用高效液相色譜法[6]和液質(zhì)聯(lián)用法[7]，主要涉及的農(nóng)產(chǎn)品及食品包括谷物和油料作物[8-9]、蔬菜[10-12]、甘蔗等糖料作物[13-14]、水果[15]及動(dòng)物源性食品[16]等，但是尚未見調(diào)味料等農(nóng)產(chǎn)品中氯蟲苯甲酰胺殘留檢測方法的報(bào)道。在已報(bào)道文獻(xiàn)中，基于QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）前處理凈化方法具有快速、便捷等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于各類農(nóng)產(chǎn)品及食品中氯蟲苯甲酰胺的提取和凈化[9-10]。但是，由于植物源調(diào)味料的特殊氣味通常由硫化物、酚類、醇類化合物等構(gòu)成[17-19]，其基質(zhì)比較復(fù)雜，使用常規(guī)QuEChERS方法凈化處理后，在使用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）進(jìn)行分析時(shí)容易產(chǎn)生嚴(yán)重的干擾，引起回收率偏低。因此，本文利用改進(jìn)的QuEChERS方法對(duì)植物源調(diào)味料進(jìn)行凈化處理，建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC- MS/MS）測定植物源調(diào)味料中氯蟲苯甲酰胺殘留量的分析方法。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試樣品：從海口市場抽取蔥、大蒜、干辣椒、黑胡椒、白胡椒等樣品各20個(gè)，其中蔥為新鮮植株可食部分，大蒜為去皮后可食部分，干辣椒、黑胡椒、白胡椒均為干樣;從海南、安徽、湖南等產(chǎn)地抽取姜與姜莖樣品各20個(gè)，其在田間施用5%氯蟲苯甲酰胺懸浮劑7 d后采集樣品。姜莖和蔥樣品切斷后用打漿機(jī)粉碎，姜和大蒜樣品直接使用打漿機(jī)粉碎，干辣椒、黑胡椒和白胡椒使用粉碎機(jī)進(jìn)行制備，得到待測樣品。

實(shí)驗(yàn)儀器包括超高壓液相色譜系統(tǒng)（美國Waters公司），AB SCIEX API4000+質(zhì)譜系統(tǒng)（美國AB SCIEX公司），ACQUITY UPLC?BEH?C18色譜柱（100?mm×2.1 mm×1.7 ?m，美國Waters公司），高速勻漿機(jī)（德國IKA公司），微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）。

本實(shí)驗(yàn)用水均為超純水，由美國Millipore超純水系統(tǒng)制備;乙腈、甲醇（色譜純，美國Fisher試劑公司）;氯化鈉（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）;PSA吸附劑（N-丙基乙二胺，分析純，Biocomma公司）;1000 ?g/mL氯蟲苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，購自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（天津）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?樣品的前處理 ?實(shí)驗(yàn)使用改進(jìn)的QuEC hE RS方法對(duì)氯蟲苯甲酰胺進(jìn)行提取和凈化。準(zhǔn)確稱取調(diào)味料樣品10.0 g 樣品至50 mL離心管中，為提高提取效率，干樣使用超純水進(jìn)行潤濕，其中姜莖樣品加入2?mL超純水、黑胡椒和白胡椒樣品加入10?mL超純水、干辣椒樣品加入12?mL超純水，然后再加入20?mL乙腈進(jìn)行提取;高速勻漿2?min，加入1.5?g?NaCl，蝸旋劇烈振蕩1?min后，以4000?r/min的轉(zhuǎn)速離心5?min，分取5?mL上清液轉(zhuǎn)入10 mL的PSA（150 mg）凈化管中，同時(shí)加入C18吸附劑，渦旋劇烈振蕩1 min，再以4000?r/min的轉(zhuǎn)速離心5?min，取上清液2.0?mL經(jīng)0.22 ?m微孔濾膜過濾，使用UPLC-MS/MS進(jìn)行測定。

1.2.2 ?儀器分析條件 ?色譜條件：ACQUITY U PL C?BEH?C18色譜柱，柱溫35?℃，進(jìn)樣量5??L，流速為0.25?mL/min;流動(dòng)相A為0.2%甲酸水，B為乙腈;梯度洗脫，洗脫程序：0～1 min，90% A;1.0～ 3.5?min，10% A;3.5～5.0 min，90% A。

質(zhì)譜條件：電噴霧正離子（ESI+）掃描，噴霧電壓4500 V，毛細(xì)管溫度600?℃;多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式。分別選擇484.1/285.9和484.1/ 452.7作為定量和定性離子，去簇電壓為82.1 V，碰撞電壓分別為20.0、22.0 V。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?前處理方法的選擇

傳統(tǒng)農(nóng)藥殘留分析時(shí)往往需要復(fù)雜的前處理步驟，樣品制備成本較大，提取溶劑使用量多，凈化步驟繁瑣。QuEChERS方法因其分析速度快、抗干擾能力強(qiáng)、靈敏度高等獨(dú)特的優(yōu)勢，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留實(shí)驗(yàn)的前處理。由于調(diào)味料樣品中含有大量揮發(fā)性硫化物、酚類、醇類化合物等雜質(zhì)[17-19][9]，在使用QuEChERS方法進(jìn)行前處理時(shí)，樣品凈化效果不佳。因此，在PSA凈化時(shí)加入C18粉末進(jìn)行協(xié)助凈化，實(shí)驗(yàn)首先對(duì)比了加入C18粉150 mg后樣品的凈化效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2A。C18材料的加入可以有效地去除調(diào)味料樣品中復(fù)雜基質(zhì)對(duì)氯蟲苯甲酰胺提取率的影響，將氯蟲苯甲酰胺的回收率從42%～72%提高到81%～ 103%。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化了不同質(zhì)量的C18粉末對(duì)氯蟲苯甲酰胺提取率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2B。結(jié)果表明，當(dāng)C18質(zhì)量從50 mg增加至150 mg時(shí)，不同調(diào)味料基質(zhì)中氯蟲苯甲酰胺的回收率從39%～68%提高到89%～106%，當(dāng)C18質(zhì)量從150?mg增加至250 mg時(shí)，氯蟲苯甲酰胺的回收率無顯著變化，因此，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中添加150?mg的C18粉末進(jìn)行凈化。

2.2 ?檢測條件優(yōu)化

2.2.1 ?液相色譜條件 ?使用C18超高壓液相色譜柱對(duì)氯蟲苯甲酰胺進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氯蟲苯甲酰胺在C18色譜柱上具有較好的保留性，可以滿足分析的需求。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步比較了乙腈水和乙腈-0.2%甲酸水2種流動(dòng)相體系，結(jié)果表明，加入0.2%甲酸與乙腈-水流動(dòng)相中，在改善峰型的同時(shí)還可使基線更加穩(wěn)定。在正離子模式下，0.2%甲酸的加入還增加了氯蟲苯甲酰胺離子化所需的H+，不僅增強(qiáng)了離子化效率，還提高了檢測靈敏度。因此選取了乙腈-0.2%甲酸水體系作為流動(dòng)相。同時(shí)優(yōu)化調(diào)整了0～1.0?min、1.0～3.5?min、3.5～ 5.0?min，3個(gè)時(shí)間段流動(dòng)相中乙腈和0.2%甲酸水的比例，確定了最佳的梯度洗脫條件。

2.2.2 ?質(zhì)譜條件優(yōu)化 ?本方法的典型色譜圖見圖3，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）進(jìn)行檢測，MRM可以通過消除背景干擾來提高檢測靈敏度。首先對(duì)0.5??g/mL的氯蟲苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液注入ESI離子源中，在正離子檢測方式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析，得到穩(wěn)定且豐度高的母離子碎片m/z 484.1。進(jìn)一步優(yōu)化去簇電壓后，對(duì)母離子碎片進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，得到二級(jí)質(zhì)譜碎片的全譜信息。優(yōu)化碰撞電壓，選擇兩個(gè)信號(hào)最強(qiáng)的兩個(gè)碎片離子m/z 285.9、m/z 452.7離子對(duì)，分別作為定量離子和定性離子進(jìn)行分析。

A：0.5 ?g/mL基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液;B：空白樣品;

C：0.5 ?g/mL加標(biāo)回收樣品。

A： ?Standard in matrix solution， 0.5 ?g/mL;

B： Blank sample; C： Spiked ginger sample， 0.5 ?g/mL.

2.3 ?基質(zhì)效應(yīng)

實(shí)驗(yàn)分別使用姜、姜莖、蔥、蒜、干辣椒、黑胡椒、白胡椒等7種調(diào)味料空白樣品，按照樣品提取方法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，得到樣品提取液，分別使用純?nèi)軇┖蜆悠诽崛∫号渲?.005、0.050、0.200 ?g/mL 3個(gè)濃度水平氯蟲苯甲酰胺溶液，分別測定得到純?nèi)軇┲修r(nóng)藥的響應(yīng)值（A）和樣品提取液中農(nóng)藥響應(yīng)值（B），則樣品基質(zhì)效應(yīng)= A/B×100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過前處理后植物源調(diào)味料樣品的基質(zhì)效應(yīng)在91%～115%，說明本方法具有很好的凈化效果，可以較好的去除樣品中基質(zhì)的干擾。

2.4 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法檢出限

以濃度1000 ?g/mL的氯蟲苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液作為母液，使用甲醇逐級(jí)稀釋法分別配置0.005、0.02、0.05、0.1、0.2 ?g/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，外標(biāo)法進(jìn)行定量，按所確定檢測條件，以氯蟲苯甲酰胺對(duì)照溶液濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程Y=2795500X+22700，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)優(yōu)于0.999。以定量離子響應(yīng)的3倍信噪比和10倍信噪比（S/N）分別計(jì)算檢出限（LOD）和定量限（LOQ），得到氯蟲苯甲酰胺的LOD和LOQ分別為0.002 mg/kg和0.005 mg/kg。其中，LOQ低于國標(biāo)GB 2763-2016中所規(guī)定的最低氯蟲苯甲酰胺殘留限量值（0.02～20 mg/kg），滿足國家標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)要求。

2.5 ?回收率及方法的精密度

以不含氯蟲苯甲酰胺的植物源調(diào)味料空白樣品，分別在0.005、0.05、0.2 mg/kg 3個(gè)水平進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度平行5次，相關(guān)結(jié)果見表1所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的加標(biāo)平均回收率在70%～ 108%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.9%～10%之間。參考NY/T 788-2004農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則，實(shí)驗(yàn)結(jié)果加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合農(nóng)藥殘留測定允許范圍，說明方法的準(zhǔn)確度符合殘留檢測要求。

2.6 ?實(shí)際樣品檢測

利用本方法進(jìn)行檢測對(duì)抽取的樣品進(jìn)行檢測，所有樣品均配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，研究所抽取的姜、蔥、蒜、干辣椒、黑胡椒、白胡椒等樣品均未檢出氯蟲苯甲酰胺，20個(gè)姜莖樣品中，有6個(gè)樣品被檢出，濃度范圍為0.082～0.263 mg/kg。本方法具有良好的靈敏度和重現(xiàn)性，可用于滿足市場樣品監(jiān)測的需求。

3 ?結(jié)論

植物源調(diào)味料中含有大量硫化物、酚類、醇類化合物通常影響農(nóng)藥殘留的定量分析，其回收率較低。傳統(tǒng)的QuEChERS方法使用PSA作為凈化材料，由于PSA材料的硅膠表面鍵合極性官能團(tuán)，主要吸附樣品中的強(qiáng)極性雜質(zhì)，如有機(jī)酸、色素以及糖等。C18材料含有十八烷基，對(duì)非極性物質(zhì)有較高的容量，其可去除油脂等非極性雜質(zhì)，并對(duì)樣品中硫化物等雜質(zhì)具有很好的去除效果。因此，本方法同時(shí)使用PSA和C18材料進(jìn)行凈化，有效地去除了樣品中的雜質(zhì)干擾。此外，由于干辣椒、胡椒等樣品含水量較低，使得氯蟲苯甲酰胺的回收率偏低，因此在提取過程中加入2?mL超純水，提高了方法的回收率，保證了方法在樣品分析時(shí)的回收率在70%～108%之間，滿足了分析的需求。

串聯(lián)質(zhì)譜具有良好的選擇性和靈敏度，近年來已經(jīng)發(fā)展成為農(nóng)藥殘留分析的主要技術(shù)，但是方法在對(duì)于復(fù)雜樣品分析的時(shí)候容易受到基質(zhì)效應(yīng)的干擾，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。本研究選擇使用改進(jìn)后的QuEChERS方法進(jìn)行前處理，采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測植物源調(diào)味料中氯蟲苯甲酰胺殘留，重點(diǎn)通過PSA和C18材料對(duì)樣品中的極性和非極性雜質(zhì)進(jìn)行凈化，有效地消除了不同性質(zhì)雜質(zhì)對(duì)樣品分析的影響，保證了方法的準(zhǔn)確性，在測定范圍內(nèi)線性關(guān)系較好，平均回收率和RSD均滿足檢測要求，可很好的滿足植物源調(diào)味料中氯蟲苯甲酰胺殘留量的檢測分析。

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