水環境中甲狀腺激素干擾物分析方法研究進展

周 秀 花,2，趙 高 峰2，趙 曉 輝2，張 盼 偉2，李 昆2，熊 楠，金 士 威

(1.中南民族大學 化學與材料科學學院，湖北 武漢 430074； 2.中國水利水電科學研究院，北京 100038)

隨著工農業的發展和人民生活水平的日益提高，各種化工產品、醫藥產品、農業化肥、除草劑以及殺蟲劑等有機化學產品通過工業廢水和生活污水的直接排放以及農用化學品的土壤滲漏、地表徑流和大氣沉降進入到水體中，使得大量的有機污染物進入水環境，給水體的生態環境造成嚴重的威脅[1]。內分泌干擾物(Endocrine disruptors, EDs)是一類廣泛存在于生活污水、河流、湖泊及海洋等水環境中的污染物。20世紀90年代以來的研究表明，在長期、低劑量暴露下，EDs能夠干擾人類和動物的內分泌系統，導致生殖功能下降、生長發育異常和免疫力降低等一系列癥狀，甚至有致癌、致畸、致突變的“三致”作用，對生態環境和生物體的健康產生危害[2]。EDs在水環境中的污染特征研究已是當前學術界和公眾共同關注的熱點問題之一。

根據內分泌干擾機制，EDs可分為雌激素類干擾物、雄激素類干擾物、甲狀腺激素類干擾物、腎上腺素類干擾物、胰島素類干擾物、孕激素類干擾物、糖皮質激素類干擾物等。其中，對甲狀腺激素的干擾效應的研究，是近年來學術界廣泛關注的熱點。

甲狀腺是脊椎動物體內重要的內分泌腺，其分泌的甲狀腺激素(Thyroid Hormone，TH)在調節生長、組織分化、能量代謝和維護大腦功能等方面發揮著非常重要的作用，是人類和動物生理過程中不可或缺的重要激素[3]。研究證實多種環境污染物，包括酚類化合物、溴代阻燃劑、農藥等可影響甲狀腺的正常功能，如抑制TH的合成和分泌、抑制甲狀腺對碘的吸收等[4]。這類對TH有干擾效應的化合物被稱為甲狀腺激素干擾物(Thyroid Hormone Disruptors，THDs)。THDs已成為繼環境雌激素之后最重要的一種EDs。研究顯示，多種THDs可以通過與TH或TH受體結合模擬TH作用來影響甲狀腺激素的合成、分泌、轉運、代謝等環節，形成多種作用機制來干擾甲狀腺功能。例如雙酚A(BPA)[5]、多溴聯苯醚(PBDEs)和多氯聯苯(PCBs)[6]通過干擾甲狀腺激素(TH)的信號傳導和調節，導致甲狀腺功能紊亂。有研究發現多種THDs的暴露能引起甲狀腺濾泡細胞肥大、厚度增大、膠質減少、血管增生和充血等現象[7]，如Lee S.H.等[8]研究表明2,3,7,8-四氯代二苯并二噁英(TCDD)能導致大鼠甲狀腺組織充血和腫脹，濾泡體積顯著減小；Zhang Z.F等[9]關于2,2′,4,4′-四溴聯苯醚(BDE-47)可引起小鼠肝臟甲狀腺激素受體TRα1、TRβ1mRNA蛋白的表達，表明了THDs對甲調基因及TH代謝關鍵酶也產生影響。

鑒于水環境中的THDs種類繁多、分布廣泛，已經對人類和動物的健康存在潛在的威脅，開發建立水環境中的快速、可靠、靈敏、準確THDs的檢測方法已成為當務之急。本文綜述了目前水環境中THDs的主要分析方法—化學分析法和生物測試法，以期更好地開展對水環境中THDs的污染特征及生物學效應評價。

1 甲狀腺激素干擾物的化學分析方法

甲狀腺激素干擾物在水環境中濃度極低，且水體中復雜基質干擾較大，在分析前一般要經過樣品前處理過程，以富集痕量組分、消除基體干擾、提高方法靈敏度以及去除對儀器或分析系統有影響的物質[10]。化學分析方法主要分為樣品前處理技術和儀器分析方法。而前處理技術是儀器分析前的必要步驟。因此，樣品前處理在化學分析中起著重要作用，它是水環境中THDs分析的關鍵環節之一。

1.1 樣品前處理技術

在環境水樣分析中，采集的樣品具有復雜性、多樣性以及痕量性等特點，因此樣品在進行儀器分析檢測之前，一般需要對樣品進行前處理，以去除具有干擾作用的非目標化合物[11]。樣品前處理包括提取、凈化、濃縮等步驟。對于水環境中THDs檢測，常見的前處理技術包括：采用索氏萃取(Soxhlet extraction, SE)對水環境中固體或半固體的樣品進行目標化合物的提取，通過液液萃取(Liquid-liquid extraction, LLE)對水環境中的水體進行目標化合物的提取。作為最傳統的萃取方法，它們具有萃取效果好、設備裝置簡單、成本低、可同時萃取多個樣品等優點，但也存在萃取劑用量大、耗時長、分析人員勞動強度大等缺點。此外，超聲波萃取(UE)、固相萃取(SPE)、固相微萃取(SPME)、微波輔助萃取(MAE)、分散液液萃取(DLLME)、超臨界流體萃取(SFE)、單液滴微萃取(SDME)、攪拌棒吸附萃取(SBSE)、分子印跡固相萃取(MISPE)等都是近年來普遍使用的萃取技術。表1對這些萃取方法進行了比較。

1.2 儀器分析方法

1.2.1氣相色譜(GC)和氣相色譜-質譜法(GC/MS)

GC是THDs最常用的測定方法(見表2)。為了提高分析技術的全面適應性，常常將具有高選擇性、高靈敏度以及高分辨率的質譜與許多分離過程相聯接。對于THDs的定性定量研究，應用最廣、發展最快的方法是GC/MS，GC/MS由于具有良好的分離效率以及高分辨率被用于測定環境水體中的THDs。目前，已建立一個包含十幾萬種標準物質的質譜庫，例如美國國家標準技術研究院建立的NIST譜庫[21]，能夠快捷查出物質及其性質。近年來，GC/MS法因其高靈敏度、高通用性和高選擇性而成為檢測痕量THDs的重要手段，且經選擇離子檢測(SIM)可以達到更高的靈敏度，同時能夠準確證明化合物的結構。但是GC/MS并不適用于一些熱不穩定性、需要衍生化再進行檢測的THDs。

表1 樣品前處理萃取技術的比較Tab.1 Comparison of extraction techniques in sample pretreatment

1.2.2液相色譜(LC)和液相色譜-質譜法(LC/MS)

雖然GC和GC/MS是水環境中THDs檢測的一種重要的方法，但是隨著THDs種類的增加，對儀器條件要求越來越高。而LC能有效分離熱不穩性高沸點化合物的分離與MS很強的組分鑒定相結合形成了LC/MS技術。LC/MS是一種分離分析復雜有機混合物的有效手段，可以對THDs進行可靠和明確的量化[22]。對于那些相對分子量大、高沸點、熱穩定性差的THDs(如酚類化合物、固醇類等化合物)，LC和LC/MS方法顯示出其優勢，有助于全面把握各種THDs的污染現狀。M Khaksari等[23]應用LC/MS檢測廢水中THDs，檢出限可達到ppt級水平。

伴隨著超高效液相(UPLC)及其超高效液相質譜(UPLC/MS)甚至是超高效液相色譜—三重四級桿串聯質(UPLC-MS/MS)的出現，THDs的分析和檢測效率大大提高，試劑消耗大幅下降。UPLC-MS/MS是一種準確度高、精密度高、樣品處理簡單、無雜質干擾、分離范圍廣的快速分離方法，它對化合物的結構破壞性小，適合THDs的分離。

2 甲狀腺激素干擾物的生物測試方法

化學分析定性準確，但設備要求高，費用昂貴，而且不能直接檢測出水環境甲狀腺激素的生物干擾效應，而生物測試方法可通過研究水環境中水體作用下生物體內基因表達的上調或下抑、蛋白合成的改變、細胞的增殖以及組織的病變等各種指標的變化，直接表征甲狀腺激素可能給生物體帶來的影響。因此，在環境THDs研究領域內，生物檢測法成為近年來的研究熱點。生物測試法一般按照測試對象不同可以分為活體檢測和離體檢測。

表2 水環境中甲狀腺激素干擾物化學分析方法Tab.2 Chemical analysis of THDs in water environment

2.1 活體檢測法

活體檢測法[40]主要通過檢測水體中暴露于生物體內甲狀腺激素水平、觀察甲狀腺組織改變等表征甲狀腺激素的生物干擾效應。活體檢測對象包括魚類、哺乳類、兩棲類動物和蛙類等。其中，魚類為常用的研究對象，主要包括斑馬魚(Danio rerio)、虹鱒魚(Rainbow trout)、黑頭木魚(Pimephales promelas)等(見表3)。孫丁等[41]在葉枯寧對大鼠血清FT4和TSH水平的影響及其時效關系研究中發現，該農藥對大鼠血清FT4和TSH水平的影響發生在5 d之內，并可繼發引起甲狀腺増生。通過觀察活體THDs形態學、組織病理學、生殖和特定生化指標的變化可以有效地對THDs進行檢測和評價。

2.2 離體檢測法

活體檢測能快速、靈敏地確定外源化合物的內分泌干擾作用[52]，相比于活體檢測法，離體檢測是一種快速而又經濟有效的方法，由于該方法的特異性，它能達到更低的檢測限[53]，能夠直接測定環境樣品的內分泌干擾活性。離體檢測法主要有分子檢測法、組織檢測法、細胞檢測法等。其中，分子檢測法和組織檢測法常用于甲狀腺疾病等醫學研究，而細胞檢測法在水環境甲狀腺激素干擾效應中應用最廣、發展最快。

表3 水環境中甲狀腺激素干擾物的活體檢測Tab.3 In vivo detection of THDs in water environment

2.2.1分子檢測法

甲狀腺疾病是內分泌系統最常見的疾病之一，也是人群中常見的疾病[54]。甲狀腺疾病的診斷十分重要，對臨床醫師的診斷方案起到關鍵性作用[55]。在醫學方面，細胞檢測存在不明確的非典型病變診斷。隨著分子遺傳學的發展，分子基因檢測能夠明顯提高細胞檢測結果[56]。Cantara S等研究表明細針穿刺細胞學與分子檢測結合能夠提高甲狀腺疾病的診斷效果[57]。

2.2.2組織檢測法

生物組織具有復雜的調控機制，且局部TH作用具有組織特異性優化[58]。組織檢測是以組織特異性方式評估TH濃度，其具有可操作性強、簡便、損傷小等優點[59]。Liu QJ等[60]研究表明多態性上皮黏蛋白(PEM)在甲狀腺癌組織中的表達及其分布特點可作為甲狀腺癌的鑒別診斷指標。

2.2.3細胞檢測法

水環境中細胞檢測法所用的細胞須富含TR，同時具有甲狀腺激素依賴性增殖的特點[61]。細胞檢測法主要采用的細胞系包括大鼠垂體瘤細胞GH3、甲狀腺細胞系中的FRTL-5、PCC13、Th1以及受體報告基因等，細胞經過改造后再對THDs進行檢測的方法稱為受體報告基因檢測。常見的甲狀腺激素干擾物的細胞檢測應用如表4所示。

表4 水環境中甲狀腺激素干擾物的細胞檢測應用Tab.4 In vitro detection of THDs in water environment

2.2.4重組基因雙雜交酵母檢測法

重組基因雙雜交酵母檢測法的主要原理為：水環境中的THDs進入酵母細胞，然后通過與甲狀腺激素受體和受體共激活因子蛋白結合，啟動報告基因LacZ的表達，表達產物β-半乳糖苷酶的活性可用于表征化合物對TR的干擾活性。李劍等已成功構建了重組人甲狀腺激素受體(hTR)和與hTR對應的共激活因子基因的雙雜交酵母體系，還對一系列環境內分泌干擾物進行了篩選[62]。但是，當外源化合物進入人體后，體內的代謝酶會對外源化合物進行芳烴化、磺化、甲基化、羥基化等作用，這些作用能促使一些化合物的內分泌干擾效應造成生物滅活或是生物活化[63]。重組基因雙雜交酵母檢測法是通過構建重組TR基因酵母，用來檢測水環境水樣中甲狀腺激素干擾活性[64]。通過對北京地區不同水體THDs的活性檢測發現，高碑店污水處理廠的AH當量為16.12～424.51 μg/L[65]、官廳水庫的AH當量為21.00～2147.20 μg/L[66]以及北京市飲用水源地的NH3當量為180.80～280.20 μg/L[67]，表明這些水體均有檢測出TR抑制活性，但尚未檢測出TR誘導活性。重組基因雙雜交酵母檢測法具有操作簡單、價格低廉的特點，因此在水環境的THDs檢測中得到了廣泛的應用。

3 展 望

鑒于水環境中的THDs對人類和動物存在健康風險，開展水環境中THDs的篩查與毒理學效應評價具有重要的現實意義。雖然目前國內外已經對水環境中THDs的分析開展了大量的研究，但是尚不深入，而且進入水環境中的THDs越來越多，今后應該從以下幾個方面開展更深入的研究工作：① 目前，對水環境中的THDs的分析主要以復雜、昂貴的儀器分析方法為主，前處理過程復雜，對多種THDs的富集效果差，有必要開發富集能力強、選擇性好的前處理方法，以實現靈敏，經濟、高通量的分析；② 應開發快速、靈敏、高效的生物檢測法，尤其是利用轉基因等技術實現高效、高通量的離體檢測；③ 水環境中的THDs濃度低，需要開發長期低劑量暴露的活體生物評價方法，以全面、正確評估THDs的健康風險。