ABCA1基因rs363717與冠心病易感性的關聯研究

楊 博

（天津市北辰醫院心內科，天津 300400）

隨著研究的不斷深入，目前認為，冠心病是由年齡、高血壓、高血脂、糖尿病、吸煙及遺傳等多種因素造成的疾病。已有研究表明，許多基因多態性可能對冠心病的發生發展起促進作用。三磷酸腺苷結合盒轉運體A1（ABCA1）基因屬于三磷酸腺苷結合盒轉運體（ABC）超家族成員之一[1-2]。ABCA1能夠對細胞內游離磷脂以及膽固醇的流出起到促進作用，參與體內高密度脂蛋白膽固醇的形成以及膽固醇的逆轉運過程，進而對動脈粥樣硬化的發生和發展產生影響[3-5]。隨著對ABCA1基因不斷深入的研究，結果顯示普通人群中ABCA1基因的多態性位點可能與冠心病的易感性相關[6]。筆者通過比較中國男性漢族人群中冠心病患者與正常對照人群之間ABCA1基因rs363717多態性位點的基因型頻率，分析中國漢族人群冠心病易感性與ABCA1基因rs363717多態性間的關聯性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 研究對象包括165例滿足世界衛生組織制定的冠心病的定義以及診斷標準的冠心病患者（冠心病組），以及165例健康人（對照組）。

冠心病組：由至少兩位經驗豐富的醫生通過選擇性冠狀動脈造影證實，患者的左主干、前降支、回旋支以及右冠狀動脈存在一處及以上的內徑狹窄不低于50%。

對照組：正常對照組受試者滿足無冠心病相關臨床癥狀以及冠心病史，心電圖檢查結果顯示各項指標均在正常范圍內。

此外，冠心病組與正常對照組受試者全部是我國年齡50～70歲的男性漢族人群，兩組受試者在收縮壓、舒張壓、血總膽固醇（TC）水平、甘油三酯（TG）水平、高密度脂蛋白水平（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）水平、空腹血糖以及是否合并高血壓、糖尿病、吸煙及飲酒方面均相匹配（經正規治療后），兩組受試者間不存在血緣關系，本研究選取受試者時排除惡性腫瘤患者以及嚴重肝腎功能不全者。

1.2 冠心病患者冠狀動脈病變支數的判定標準 由至少兩位經驗豐富的醫生判定冠心病患者左主干、前降支、回旋支以及右冠狀動脈阻塞病變的程度，其狹窄大于或等于50%判定為有意義。此外，單支病變、雙支病變以及三支病變的定義標準以有意義病變累及支數為依據，左主干受到累及者計為兩支病變。

1.3 入選標準 采用問卷調查的方式統計兩組受試者年齡、是否合并高血壓、糖尿病、吸煙及飲酒方面的基本信息。主要相關因素與指標包括血糖、收縮壓、舒張壓、血清總膽固醇水平、甘油三酯水平、高密度脂蛋白水平以及低密度脂蛋白水平等。

入選標準如下：年齡50～70歲，男性，經正規藥物治療后，空腹血糖 4～7 mmol/L；血壓 100～140/60～90 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）；TC 小于 5 mmol/L；TG小于3 mmol/L；HDL-C大于 0.8 mmol/L；LDLC小于3.5 mmol/L。

1.4 試驗方法 按試劑盒說明從白細胞中提取基因組DNA。

1.4.1 DNA濃度以及純度的檢測步驟 DNA濃度以及純度采用分光光度計進行檢測，分別測定DNA樣品在260納米以及280納米波長下的吸光度值（即A260與A280）。DNA樣品含量通過朗伯-比爾定律進行計算，具體計算公式為：DNA樣品物質的濃度（mol/L）=DNA樣品在260納米波長下的吸光度值/（摩爾吸光系數×DNA樣品的光程），DNA樣品的純度通過A260與A280的比值進行評估。為確保實驗數據的準確性，本研究中采用的將DNA樣品稀釋至100 ng/μL，純度保持在 1.8～1.9 之間。

1.4.2 ABCA1基因rs363717多態性位點的檢測

1）聚合酶鏈式反應（PCR）引物序列：

正向引物序列：5’-ACGTTGGATGCTGAAGTCTTACACCTTTAGC-3’。

反向引物序列：5’-ACGTTGGATGGGGAAGTTCAAGTGATCTTTC-3’。

2）PCR反應在PCR熱循環以上進行，反應產物置于4℃冰箱保存以備使用。具體反應體系及反應條件見表1，表2。

表1 ABCA1基因rs363717多態性位點檢測PCR反應體系

3）酶切反應具體反應體系見表3。

表3 ABCA1基因rs363717多態性位點酶切反應體系

反應條件：將上述反應體系保持于37℃的水浴過夜后將產物進行經瓊脂糖（濃度為2.5%）凝膠電泳，電壓為90 V，時間為60 min，電泳結束后采用紫外光凝膠成像系統鑒定受試者該多態性位點的基因型。

1.5 統計分析 采用問卷調查的方式統計兩組受試者年齡、是否患有高血壓、糖尿病、吸煙及飲酒方面的基本信息；測定兩組受試者不同多態性位點的基因型并計算相應的等位基因型頻率；兩組受試者中等位基因頻率是否滿足群體代表性通過Hardy-Weinberg平衡來檢驗。本研究中數據全部采用SPSS20.0統計分析軟件進行處理。采用方差分析計量數據，數據結果采用均數±標準差（x±s）表示，采用的統計學方法包括t檢驗、卡方檢驗，P<0.05表示差異存在統計學意義。

2 結果

2.1 ABCA1基因rs363717多態性位點兩組受試者的基本臨床信息比較 本研究共包括ABCA1基因rs363717多態性位點基因分型的受試者330例，冠心病組以及正常對照組中分別包含165例受試者，為排除冠心病主要危險因素如血壓、血脂、血糖水平、吸煙等對本研究結果的影響，入選標準做了限定，使其各方面均相匹配。通過分析顯示，兩組受試者在年齡、收縮壓、舒張壓、TC水平、TG水平、HDL-C水平、LDL-C水平、空腹血糖以及是否患有高血壓、糖尿病、吸煙及飲酒方面均不存在顯著差異（P>0.05），見表 4。

2.2 兩組受試者ABCA1基因rs363717多態性位點的基因型及等位基因分布情況 Hardy-Weinberg平衡檢驗結果顯示，在ABCA1基因rs363717多態性位點的基因型頻率的分布上，冠心病組與正常對照組受試者均滿足Hardy-Weinberg平衡（P>0.05），故可以推斷本研究中選取的受試者具有良好的代表性，研究數據可信度高；冠心病組受試者AA、AG以及GG 3種基因型的分布與正常對照組之間均不存在顯著差異（P>0.05）；冠心病組內AA基因型頻率顯著高于AG以及GG基因型，且差異存在統計學意義（P<0.05）；冠心病組受試者ABCA1基因rs363717多態性位點的A等位基因頻率（76.06%）高于正常對照組（66.67%），且差異存在統計學意義（P<0.05），見表 5。

2.3 冠心病組中ABCA1基因rs363717多態性位點各基因型中的血脂水平情況 本研究通過結合LSD法以及單因素方差分析法，比較冠心病組受試者中ABCA1基因rs363717多態性位點AA基因型與（AG+GG）基因型中的血脂濃度水平，結果顯示，AA基因型與（AG+GG）基因型在 TC、TG、HDL-C以及LDL-C水平上均不存在顯著差異（P>0.05），見表 6。

2.4 ABCA1基因rs363717多態性基因型頻率與冠心病患者冠狀動脈病變程度的關聯 研究結果顯示：冠心病患者AA基因型中發生單支病變、雙支病變以及3支病變的患者分別為57例、36例及25例，（AG+GG）基因型中發生單支病變、雙支病變以及3支病變的患者分別為23例、19例及15例，兩組基因型之間不存顯著差異（P>0.05），即未發現血管病變支數與rs363717多態性位點的G等位基因之間的關聯性，見表7。

表4 兩組受試者的基本臨床信息比較（x±s）

表5 兩組受試基因型及等位基因分布比較

表6 AA基因型與（AG+GG）基因型中血脂水平比較（x±s）

表7 基因型頻率與冠心病患者冠狀動脈病變程度的關聯

3 討論

通過入選標準限定，本研究分析顯示，兩組受試者在年齡、收縮壓、舒張壓、TC水平、TG水平、HDL-C水平、LDL-C水平、空腹血糖以及是否合并高血壓、糖尿病、吸煙及飲酒方面均不存在顯著差異（P>0.05），且Hardy-Weinberg平衡檢驗結果顯示，在APOA5基因1131C和c.553T多態性位點的基因型頻率的分布上，冠心病組與正常對照組受試者均滿足Hardy-Weinberg平衡（P>0.05），故可以推斷本研究中選取的受試者具有良好的代表性，研究數據可信度高。

在ABCA1基因啟動子區域、3’UTR等非蛋白編碼區以及編碼氨基酸序列的編碼區均存在ABCA1基因的多態性位點[7-8]。rs363717位點處在ABCA1基因的3’UTR的非編碼區，該區域的位點突變可能導致ABCA1基因的二級結構發生變化，進而對mRNA的穩定性造成影響，此外還可能對mRNA以及其互補結合miRNA間的相互作用產生影響[9-11]。故而推斷rs363717位點多態性位點可能通過阻礙mRNA和miRNA互補結合過程以及增加ABCA1基因mRNA的穩定性來激活ABCA1蛋白的表達，降低冠心病的易感性[12]。本研究ABCA1基因rs363717多態性位點與冠心病的關聯性結果顯示：冠心病組受試者ABCA1基因rs363717多態性位點的A等位基因頻率（76.06%）高于正常對照組（66.67%），且差異存在統計學意義（P<0.05），由此可以推斷rs363717多態性位點的A等位基因可能與中國男性漢族人群冠心病的易感性相關。國外研究表明，當rs363717位點的等位基因A突變為G時，冠心病的發病風險降低，推斷等位基因G是冠心病的保護因子[13]，進而推斷G等位基因亦可能是中國男性漢族人群冠心病的保護位點。

本研究通過對ABCA1基因rs363717多態性基因型頻率與冠心病患者冠狀動脈病變程度比較，AA基因型與（AG+GG）基因型之間不存顯著差異（P>0.05），未發現中國男性漢族人群中冠心病患者血管病變支數與rs363717多態性位點的G等位基因之間的關聯性。