黃瓜抗感材料接種尖孢鐮孢菌后根系游離氨基酸的差異分析

李亞莉 侯 棟 岳宏忠 張東琴

（甘肅省農業科學院蔬菜研究所，甘肅蘭州730070）

黃瓜是世界廣泛種植的蔬菜作物，其種植面積位居我國保護地之首，對我國蔬菜的均衡供應及市場的穩定起著非常重要的作用（周紅梅 等，2015）。黃瓜枯萎病是一種土傳病害（Shen et al.，2008；喬永旭 等，2015），由尖孢鐮孢菌黃瓜專化型（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum）引起，又叫死秧病、蔓割病、萎蔫病，是由土壤或種子帶菌傳播，從根部侵入，在維管束中寄生的系統性 病 害（Zhao et al.，2012；Zhang et al.，2013；Zhang et al.，2014；石延霞 等，2015）。尖孢鐮孢菌在土壤中有很強的隱蔽性，對不良環境有極強的抵抗力，能以菌絲體、厚垣孢子在土壤和空氣中存 活5～6 a，甚 至10 a 以 上（Vakalounakis &Chalkias，2004；Wu et al.，2014），在適宜的條件下能快速繁殖，導致病害發生。枯萎病發生后會造成嚴重的經濟損失，甚至絕收。土傳病害的防治一直是科學研究領域的難題（Aleandri et al.，2015）。目前，化學防治黃瓜枯萎病易造成土壤和環境的污染，輪作倒茬雖然有效，但給菜農的茬口安排帶來困難，嫁接防治效果較好，但成本較高且需較好的嫁接技術，相比之下，選育抗枯萎病的黃瓜新品種是最安全、經濟、高效的方法（毛愛軍 等，2008；Huang et al.，2012；Mehta et al.，2014；高長敏 等，2018）。但由于目前對黃瓜抗枯萎病機理的研究不夠深入，造成抗病品種的選育周期較長，不能及時有效解決生產實際。

氨基酸是植物氮代謝中的重要代謝產物，它以游離態、多肽和蛋白質的形式存在。游離氨基酸是病原菌的營養物質，可被病原菌當作氮源、碳源吸收利用，合成自身的蛋白質。有些氨基酸對病原菌有致害作用，參與植物的抗病機制（單治國 等，2017）。根系是合成游離氨基酸的重要場所。目前，對接種病原菌后抗感材料根系游離氨基酸的動態變化缺乏深入而全面的研究。因此，本試驗對接種尖孢鐮孢菌后的抗感黃瓜根系進行游離氨基酸種類及其含量比較，以期從病原菌和植株根系游離氨基酸互作角度，揭示黃瓜抗枯萎病的生理機制，為選育抗枯萎病的黃瓜新品種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

黃瓜抗病品系（T111）和感病品系（R00950）均由甘肅省農業科學院蔬菜研究所提供。供試菌種為尖孢鐮孢菌黃瓜專化型（Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum）4 號生理小種，由北京市農林科學院蔬菜研究中心提供。

1.2 試驗設計與處理

2018 年4 月將供試黃瓜品系播種于本所育苗溫室，同時在甘肅省測試中心實驗室完成游離氨基酸含量的測定。苗期接種采用翁祖信的胚根接種法，稍有改動。孢子懸浮液的制備：將保存備用的尖孢鐮孢菌菌種接種到PDS 培養基中，待培養皿中布滿菌絲后，倒入少許滅菌水，刮取菌絲，用雙層紗布過濾，除去菌絲，將濾液經5 000 r · min-1離心10 min，取其沉淀物，加蒸餾水稀釋成含孢子1×106個 · mL-1的孢子懸浮液備用。接種方法：將催芽后胚根長約1 cm 的種子，浸入配制好的孢子懸浮液中30 min，然后倒出孢子懸浮液，將種子播于育苗盤中。未接種對照用同法浸入滅菌水中相同時間。試驗共4個處理，即抗病、感病材料對照（CK）和抗病、感病材料接種病原菌處理（I）。每天視基質濕度適量澆水，并隨機挪動育苗盤。

1.3 游離氨基酸含量測定方法

接種病原菌之后8、12、16、20 d 采樣，每次采樣各處理3 次重復，每重復20 株苗。游離氨基酸含量測定使用氨基酸全自動測試儀，檢測方法參照GB/T 18246—2000：稱取3 000 mg 的植物樣品放入研缽中，準確加入15 mL 的3%磺基水楊酸溶液進行研磨，轉移至50 mL 的離心管中，在10 000 r · min-1下離心5 min，準確吸取1 mL 上清液，濃縮近干，準確加入1 mL 樣品稀釋液，利用漩渦儀復溶，過0.22 μm 過濾頭，上機。測定的游離氨基酸共34 種：分別為磷酸絲氨酸、牛磺酸、磷乙醇胺、尿素、天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、α-氨基已二酸、甘氨酸、丙氨酸、瓜氨酸、α-氨基丁酸、纈氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、β-丙氨酸、β-氨基異丁酸、γ-氨基丁酸、組氨酸、3-甲基組氨酸、1-甲基組氨酸、肌肽、色氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、精氨酸、羥脯氨酸和脯氨酸。

1.4 數據處理

試驗數據用Microsoft Excel 和SPSS 16.0 軟件進行處理、統計分析和顯著性水平檢驗，數據均為“平均數±標準偏差”格式。

2 結果與分析

2.1 抗感材料根系游離氨基酸總量的變化

圖1 抗感材料根系游離氨基酸總量的變化

試驗發現（圖1），隨著接種后時間的延長，抗病材料接種病原菌處理和對照的根系游離氨基酸總量均呈下降趨勢。接種后8、12、16 d 和20 d，抗病材料接種病原菌處理的游離氨基酸總量分別為421.38、506.23、368.51、250.35 μg · g-1（FW），抗病對照的游離氨基酸總量分別為385.29、364.68、276.88、199.14 μg · g-1（FW），各時間點游離氨基酸總量均表現為接種病原菌處理高于對照，較對照分別增加了9.37%、38.81%、33.09%、25.72%。隨著接種后時間的延長，感病對照的游離氨基酸總量呈下降趨勢，而感病材料接種病原菌處理的游離氨基酸總量呈上升趨勢。接種后8、12、16 d 和20 d，感病材料接種病原菌處理的游離氨基酸總量分別為339.51、419.77、410.17、448.43 μg · g-1（FW），感病對照的游離氨基酸總量分別為283.17、280.81、203.95、145.14 μg · g-1（FW），各時間點游離氨基酸總量也表現為接種病原菌處理高于對照，分別較對照增加19.89%、49.49%、101.11%、208.96%。以上試驗結果表明，接種后4 個時間點，感病材料接種病原菌處理的游離氨基酸總量較對照增加的百分比均較抗病材料高，說明感病材料根系游離氨基酸總量受病原菌的影響較大。

2.2 抗感材料根系游離氨基酸種類和含量變化

從表1 可以看出，抗病材料根系共檢測出25種游離氨基酸，感病材料根系共檢測出24 種游離氨基酸。抗病材料游離氨基酸含量在0.45～69.60 μg · g-1（FW）之間，感病材料游離氨基酸含量在0.45～68.92 μg · g-1（FW）之間。接種后8、12、16 d 和20 d，抗感材料大部分游離氨基酸表現為接種病原菌處理大于對照或與對照差異不顯著，少部分游離氨基酸表現為接種病原菌處理小于對照。尿素、天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、 γ-氨基丁酸、組氨酸、賴氨酸和精氨酸在抗感材料的4 個時間點均表現為接種病原菌處理顯著大于對照或與對照差異不顯著。磷酸絲氨酸在抗感材料的4 個時間點均表現為接種病原菌處理顯著小于對照或與對照差異不顯著。接種后8、12、16 d 和20 d，β-丙氨酸和鳥氨酸在抗病材料中表現為接種病原菌處理小于對照，而在感病材料中表現為接種病原菌處理顯著大于對照；亮氨酸則相反，在抗病材料中表現為接種病原菌處理顯著大于對照，而在感病材料中表現為接種病原菌處理小于對照。

隨著接種后時間的延長，抗感材料大部分游離氨基酸含量呈下降趨勢，少部分游離氨基酸含量呈上升趨勢。抗感材料接種病原菌處理和對照中，磷酸絲氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、瓜氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和β-丙氨酸均呈下降趨勢。天冬酰胺的含量在抗感材料接種處理及對照中均不斷增加。天冬氨酸和賴氨酸在抗病對照中呈下降趨勢，而在感病材料接種病原菌處理及對照中含量不斷增加。尿素和精氨酸的含量在抗病材料接種病原菌處理和對照、感病材料對照中均呈下降趨勢，而在感病材料接種病原菌處理中含量增加。γ-氨基丁酸在抗病材料接種病原菌處理及對照中含量增加，而在感病對照中呈下降趨勢。組氨酸和鳥氨酸的含量在抗病材料接種病原菌處理和對照、感病材料接種病原菌處理中呈上升趨勢，而在感病材料對照中呈下降趨勢。

3 結論與討論

游離氨基酸又叫非蛋白質氨基酸，呈游離態，其種類和數量多于蛋白質氨基酸（徐軍 等，2018 ）。植物組織中的游離氨基酸占總氮的 2%左右，但對植物的生長至關重要。游離氨基酸是植物的重要氮源，也是一種重要的生物活性物質（Egydio et al.，2013），有些游離氨基酸有促進生長、新陳代謝、免疫的功能（Cylwik et al.，2005；Morris et al.，2005；Mateo et al.，2007；李倩倩 等，2018），植物組織中的游離氨基酸能直接或間接對環境中生物或非生物的壓力作出響應（Hoff et al.，1994；Ashraf & Harris，2004），如干旱、寒冷、修剪傷害、鹽分、重金屬、溫度、大氣污染、水壓力、病蟲害、營養等。這些環境壓力會使植物中游離氨基酸濃度發生改變，大多數植物在面對環境壓力時，會通過增減氨基酸濃度調節植物中氮代謝（Zhang et al.，2012），這種抵御方式降低了環境壓力對植物造成的傷害（Bohnert，1995）。植物根系同化、吸收的氮素主要以氨基酸和酰胺的形式進行運輸。根系中大多數氨基酸在低濃度下可作為一種碳源，被病原菌吸收利用，但其吸收利用的過程不夠清楚。游離氨基酸總量的變化與植株的抗病性、植株部位、侵染狀態和時間均有關系。本試驗結果表明，接種病原菌后16、20 d，感病材料接種病原菌處理的游離氨基酸總量分別高于抗病材料接種病原菌處理。這與前人研究結果一致（蔣玉蓉 等，2005；Hao et al.，2010；董鮮 等，2015；董艷 等，2015）。董鮮等（2015）對香蕉幼苗接種尖孢鐮孢菌，結果表明，接種后4、8、12 d 和16 d，根系中大部分游離氨基酸表現為未侵染植株大于侵染植株。而本試驗結果表明，接種病原菌后，抗病材料游離氨基酸總量呈下降趨勢，感病材料游離氨基酸總量呈上升趨勢。接種后8、12、16、20 d，抗病材料游離氨基酸總量分別較對照增加9.37%、38.81%、33.09%、25.72%，感病材料分別較對照增加19.89%、49.49%、101.11%、208.96%，游離氨基酸總量受病原菌的影響表現為感病材料大于抗病材料。造成研究結果不同的原因可能是由于寄主、病原菌專化型和生理小種的不同。

表1 抗感材料根系游離氨基酸種類和含量變化 μg · g-1（FW）

病原菌侵染對不同游離氨基酸的影響研究較多，如病原菌侵染后，絲氨酸、丙氨酸經丙酮酸形成乙酰CoA，后者進入三羧酸循環，從而拮抗病原菌入侵、加強呼吸作用（沈同 等，1991）。前人研究結果表明，根系氨基酸種類和含量與枯萎病抗性密切相關，且在不同作物間有較大的差異（董艷等，2014，2015；董鮮 等，2015），但對同一作物不同抗性品種的比較研究甚少。本試驗結果表明，抗感材料游離氨基酸種類相當。接種后8、12、16 d 和20 d，β-丙氨酸和鳥氨酸在抗病材料中表現為接種病原菌處理小于對照，而在感病材料中表現為接種病原菌處理顯著大于對照。亮氨酸在抗病材料中表現為接種病原菌處理顯著大于對照，而在感病材料中表現為接種病原菌處理小于對照。陳宏宇（2005）研究表明，天冬氨酸、苯丙氨酸等具有促進病原菌菌絲生長的功能，董艷等（2014）研究表明，賴氨酸、精氨酸等具有抑制病原菌生長的功能。張寧等（2008）的研究表明，當尖孢鐮孢菌侵染西瓜時，西瓜根系中精氨酸等15 種游離氨基酸的含量顯著升高。γ-氨基丁酸是植物組織中的生理活性物質，對促進生長、調節代謝、抵抗逆境和抵制病菌侵染均有利（單治國 等，2017）。而本試驗結果表明，隨著接種時間的延長，賴氨酸、尿素和精氨酸在抗病材料接種病原菌處理中呈下降趨勢，而在感病材料接種病原菌處理中含量增加；γ-氨基丁酸在抗病材料接種病原菌處理及對照中含量增加，而在感病對照中呈下降趨勢。

本試驗僅對接種后抗感材料根系游離氨基酸種類及其含量進行了研究，初步總結出接種尖孢鐮孢菌后根系游離氨基酸在抗感材料中的差異，對引起部分游離氨基酸含量不同的原因及機理還需進一步的研究。本試驗結果將為選育抗枯萎病的黃瓜新品種提供理論依據。