PDX模型在卵巢癌研究中的應(yīng)用展望

李巍　楊淑麗　田明　苗勁蔚

[摘要] 卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤，臨床表現(xiàn)不典型，主要表現(xiàn)為腹脹、腹部腫物等，病理類型多樣，異質(zhì)性特征明顯。腫瘤細(xì)胞系模型、轉(zhuǎn)基因動物模型是最為常見的卵巢癌研究模型，應(yīng)用其取得了長足的進(jìn)步，但缺點明顯。卵巢癌人源腫瘤異種移植瘤（PDX）模型為最新的卵巢癌研究模型，本文概述了卵巢癌PDX模型在卵巢癌研究中的應(yīng)用基礎(chǔ)及前景。

[關(guān)鍵詞] 卵巢癌;腫瘤異質(zhì)性;動物模型;人源腫瘤異種移植瘤

[中圖分類號] R737.31 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2019）06（c）-0045-04

Application and prospect of PDX model in ovarian cancer researches

LI Wei ? YANG Shuli ? TIAN Ming ? MIAO Jinwei

Department of Gynecologic Oncology， Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital， Capital Medical University， Beijing ? 100071， China

[Abstract] Ovarian cancer is a common gynecology oncologic tumor. Its clinical presentations are untypical， mainly including abdominal distension and pelvic mass， et al. The pathologic types of ovarian cancer are varied， so its heterogenicity is obvious. Tumor cell line modals and transgenic animal modals are commonly used ovarian cancer models， and they gain great progress in ovarian cancer researches. But their defects are also inevitable. Ovarian cancer patient derived tumer xenograft （PDX） model is a brand new cancer research model， we summarize the application base and prospect of it PDX model ovarian cancer researches.

[Key words] Ovarian cancer; Tumor heterogenicity; Animal model; Patient derived tumer xenograft

卵巢癌是婦產(chǎn)科常見的惡性腫瘤之一，80%為晚期病例，死亡率高居首位。術(shù)后晚期卵巢癌患者對于一線化療的反應(yīng)率高達(dá)75%，5年生存率約為40%，然而80%患者最終復(fù)發(fā)。多年來，卵巢癌化療方案的選擇是程式性的。無論患者的病史、臨床表現(xiàn)及病理類型等差異如何，上皮性卵巢癌的一線化療方案均是紫杉烷及鉑類藥物。復(fù)發(fā)后選擇再次手術(shù)和/或化療，鉑敏感患者繼續(xù)應(yīng)用鉑類藥物，反應(yīng)率≥30%;鉑耐藥患者選用其他二線藥物，反應(yīng)率為10%～25%，復(fù)發(fā)后生存期為12～18個月[1]。半個世紀(jì)以來，婦科腫瘤手術(shù)滿意率提升明顯，但上述情況仍未改變[2]。因而，卵巢癌是對患者生存造成最大威脅的婦科惡性腫瘤，給家庭及社會帶來了極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

1 卵巢癌是典型的異質(zhì)性腫瘤

1850年，Rudolf首次提出腫瘤是異質(zhì)性疾病，存在地域、種族、結(jié)構(gòu)等差異，從而表現(xiàn)出組織學(xué)、抗原性及藥物敏感性等不同。卵巢癌是典型的異質(zhì)性腫瘤，其異質(zhì)性情況未被認(rèn)識，病理類型多樣，含卵巢上皮性腫瘤、生殖細(xì)胞腫瘤、性索間質(zhì)腫瘤等，卵巢上皮性癌（卵巢癌）占卵巢惡性腫瘤的80%。依據(jù)病理形態(tài)及分子生物學(xué)特點不同，卵巢癌又分為Ⅰ型和Ⅱ型[2]，Ⅰ型包含低級別漿液性癌、黏液性癌、子宮內(nèi)膜樣癌等，存在良性-交界性-低度惡性演變的序貫性，生長緩慢，多局限于一側(cè)卵巢，預(yù)后好;Ⅱ型包含高級別漿液性癌、未分化癌和癌肉瘤，一般無早期病變，侵襲性高，發(fā)現(xiàn)時多為晚期，預(yù)后差。因此，卵巢黏液性癌、子宮內(nèi)膜樣癌等Ⅰ型卵巢癌，理論上預(yù)后較好，但臨床實踐中，情況遠(yuǎn)較此復(fù)雜。早期黏液性癌預(yù)后好，5年生存率>90%，晚期黏液性癌5年生存率則<50%，WHO分級法仍將其分為高、中、低分化，無法遵循上述分型。卵巢子宮內(nèi)膜樣癌及透明細(xì)胞癌約占卵巢癌的25%[2]，認(rèn)為二者來源于子宮內(nèi)膜異位病灶的惡性演變，為Ⅰ型卵巢癌，預(yù)后好，而臨床上透明細(xì)胞癌60%為晚期，其生物學(xué)行為與Ⅰ型卵巢癌完全不同。由此，可見卵巢癌異質(zhì)性情況復(fù)雜。

2 卵巢癌模型研究現(xiàn)狀

以往卵巢癌研究主要是針對某一點，但鑒于卵巢癌復(fù)雜的異質(zhì)性情況，應(yīng)充分了解卵巢癌異質(zhì)性全貌，首先需要有效的卵巢癌異質(zhì)性研究模型。1952年Dulbecco[3]建立傳統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞系模型并開始應(yīng)用，其在腫瘤生物學(xué)研究中發(fā)揮了重要的作用，其均一性好、可控性強。例如鑒于其永生性及易得性，可用于研究某些基因?qū)?xì)胞存活、增殖及對某些激酶特異性抑制因子的影響等[4]。但缺點明顯：在體外傳代過程中，腫瘤組織的基質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白等喪失;傳代過程中歷經(jīng)酶消化等，只有適應(yīng)環(huán)境、表型一致的細(xì)胞得以存活，異質(zhì)性喪失;無氧培養(yǎng)條件下，突變情況常見[5]。腫瘤細(xì)胞系動物模型也存在上述問題。基因工程鼠模型（GEMMs）在腫瘤生物學(xué)研究中應(yīng)用較多，其缺點如下：腫瘤的異質(zhì)性決定其為多基因突變誘導(dǎo)產(chǎn)物[6]，GEMMs至少應(yīng)引入兩種癌基因和/或突變的抑癌基因，而GEMMs引入1種以上的突變非常困難;GEMMs轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物水平高于生理水平，存在偏差;GEMMs腫瘤多為散發(fā)，不能大規(guī)模研究，體內(nèi)監(jiān)測困難;腫瘤基因組圖譜研究證實，腫瘤存在突變譜的個體差異，特定基因的研究價值有限等。因而，GEMMs在腫瘤病因及異質(zhì)性研究方面存在不足。目前以細(xì)胞系為基礎(chǔ)的體內(nèi)、外研究證實有效的化療藥物，在臨床應(yīng)用中存在明顯的非靶向性毒性反應(yīng)，治療窗非常窄;復(fù)發(fā)腫瘤組織獲得了高侵襲性、難治性及致死性特點;不能清除腫瘤干細(xì)胞;基因毒性藥物暴露后引發(fā)新的基因突變等，目前并未獲得滿意的效果。如貝伐單抗、索拉芬尼等臨床前應(yīng)用前景喜人，臨床應(yīng)用效果明顯降低。因而，傳統(tǒng)的細(xì)胞系相關(guān)模型及GMMs不能作為卵巢癌異質(zhì)性研究的平臺。據(jù)此，構(gòu)建忠實反映卵巢癌異質(zhì)性的動物模型是解決上述問題的關(guān)鍵[7]，而目前人源腫瘤異種移植癌（PDX）模型為最優(yōu)選擇[8]。

在已建立的黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌等PDX模型研究[9-10]中證實其表現(xiàn)出了與來源患者相似的化療反應(yīng)等，能忠實于疾病的自然狀態(tài)。PDX模型移植物可以是腫瘤單細(xì)胞懸液或是腫瘤組織片段。單細(xì)胞懸液可以分析單個細(xì)胞表型、某細(xì)胞亞群致瘤性以及確保取樣均一，但缺點是某些細(xì)胞表面分子對消化酶敏感，消化后抗原譜發(fā)生變化;腫瘤組織片段能保留細(xì)胞間作用關(guān)系及組織結(jié)構(gòu)，故目前腫瘤組織植入PDX模型是最優(yōu)選模型，能再現(xiàn)與來源患者最接近的腫瘤組織，其反映腫瘤生物學(xué)情況的準(zhǔn)確性優(yōu)于其他模型[11]。若在患者診斷之初建模、檢測，可實現(xiàn)對患者診斷及治療等的臨床指導(dǎo)。

3 PDX模型及其建立

為更好地保留基因組的完整性和腫瘤的異質(zhì)性，可以將新鮮切除的患者腫瘤細(xì)胞或組織植入免疫缺陷鼠體內(nèi)即PDX模型[12-13]。PDX模型完好保留了腫瘤的異質(zhì)性及組織結(jié)構(gòu)[14]、侵襲性脈管系統(tǒng)和支持間質(zhì)細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞生長于移植環(huán)境中，該環(huán)境提供了腫瘤組織在體內(nèi)的生理氧濃度、營養(yǎng)環(huán)境，提供了腫瘤細(xì)胞黏附的生理底物。與細(xì)胞系模型比較，PDX模型的細(xì)胞遺傳學(xué)分析提示其保留了來源腫瘤組織的染色體結(jié)構(gòu)[15]。

PDX模型的建立方法是將手術(shù)切除的新鮮腫瘤組織切成2～4 mm的碎片，通過皮下[15-16]、腎包膜下或原位種植入免疫缺陷小鼠。可以選擇BALB/c裸鼠、SCID、NOD及NSG小鼠等，其中NSG小鼠既缺乏T、B和NK細(xì)胞，也缺乏細(xì)胞因子信號傳遞能力，對人源細(xì)胞及組織幾乎沒有排斥反應(yīng)，是目前國際公認(rèn)的免疫缺陷程度最高、最適合人源移植的工具小鼠。目前，模型的成瘤周期一般為2～4個月[16]。PDX建模的成功取決于是否獲得可以傳代的PDX腫瘤，成功率為13%～77%，其中結(jié)直腸癌約為76.5%，胰腺癌約為62%，乳腺癌約為20%。腫瘤的惡性程度、分化程度及移植位點是影響移植成功率的重要因素，惡性程度越高，分化程度越低，成功率越高;皮下移植易操作、易觀察，但成功率相對較低，約為50%[17]，腎包膜下移植操作困難、觀察受限，但成功率能達(dá)到95%，原位移植更加貼近腫瘤微環(huán)境，尤其是在研究腫瘤轉(zhuǎn)移方面，更為理想，但由于其技術(shù)要求較高，建模比較困難，影響了其廣泛應(yīng)用。

4 PDX模型在卵巢癌中的應(yīng)用與展望

PDX模型在上皮性卵巢癌的研究中非常有限[18-19]，目前僅限于模型建立及化療反應(yīng)觀察等的初期階段，國內(nèi)相關(guān)研究較少，國外的研究模型在逐步建立中。Colombo等[14]成功建立了35個卵巢癌PDX模型，是截止目前建立的較大規(guī)模卵巢癌PDX模型，病理類型涵蓋透明細(xì)胞癌、黏液性癌及癌肉瘤，其選擇裸鼠作為移植動物，進(jìn)行肩胛下移植，成功率約為60%。Bobbs等[7]建立了一系列的卵巢癌PDX模型，選擇SCID鼠作為移植動物，進(jìn)行腹腔移植，成功率約為74%，其發(fā)現(xiàn)早期復(fù)發(fā)和死亡患者具有更高的移植容受率。這些PDX模型既保留來源腫瘤的臨床病理特征及遺傳改變，也表現(xiàn)出與來源患者一致的耐藥反應(yīng)[20-21]。Ricci等[22]建立了一系列卵巢癌PDX模型，保留了來源組織的生物學(xué)、組織學(xué)、分子及藥理學(xué)特性，其對順鉑敏感性不同，包含敏感及耐藥，其反應(yīng)與來源患者一致性好;其研究表明，無論腫瘤對順鉑的初次治療反應(yīng)如何，治療后再發(fā)腫瘤對順鉑的治療反應(yīng)明顯降低，作為體內(nèi)研究模型，其對新藥及聯(lián)合用藥的研究均具有重要意義。Ricci等[23]建立了一些特殊的卵巢癌PDX模型，如復(fù)發(fā)腫瘤、AKT和ERK通路鉑耐藥腫瘤，利用其驗證了多藥抗腫瘤的療效（紫杉醇、貝伐單抗、MEK抑制劑）。模型實驗顯示三藥聯(lián)合應(yīng)用耐受性好，抗腫瘤療效優(yōu)于兩藥聯(lián)合，模型為研發(fā)新的二線抗腫瘤藥物的重要工具，類似的研究中，也建立了一系列順鉑敏感性不同的卵巢癌PDX庫，因為DNA損傷修復(fù)通路是決定腫瘤對順鉑敏感性的重要因素，其檢測了20種mRNA表達(dá)基因，如核酸切除修復(fù)、同源重組基因，并分析了其與順鉑治療反應(yīng)的對應(yīng)關(guān)系。結(jié)果顯示，42例卵巢癌PDX模型中，DNA修復(fù)基因均差異表達(dá)，無組織特異性。高級別漿液性癌及子宮內(nèi)膜樣癌PDX模型CDK12 mRNA表達(dá)水平與TP53BP1、PALB2、XPF及POLB表達(dá)正相關(guān);TP53突變者POLQ、FANCD2、RAD51及POLB水平明顯高于TP53野生型;CDK12、PALB2及XPF mRNA水平與患者鉑抗腫瘤反應(yīng)負(fù)相關(guān);CDK12 mRNA水越高，卵巢癌復(fù)發(fā)率越高。結(jié)果表明，卵巢癌PDX模型為進(jìn)行DNA損傷修復(fù)測試的平臺，也是評估患者順鉑治療反應(yīng)的重要工具[24]。George等[19]利用卵巢癌患者腹水或腹腔沖洗液的腫瘤細(xì)胞建立了熒光素PDX模型，經(jīng)過免疫組化、基因芯片檢測及全基因組測序分析顯示其忠實于非熒光PDX模型及其來源患者腫瘤特征;熒光素模型保留了模型的遺傳多樣性、PI3K信號通路活性，模型為卵巢癌研究的有效平臺。卵巢癌PDX模型體現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景，有利于分析卵巢癌異質(zhì)性特征情況，有益于藥物篩選、個體化治療、復(fù)發(fā)分析等，有助于打破傳統(tǒng)卵巢癌臨床治療的經(jīng)驗化時代，從而提高臨床療效、改善高復(fù)發(fā)情況、提高早期診斷率。

5 PDX模型面臨的挑戰(zhàn)

在PDX腫瘤的連續(xù)傳代過程中，全基因組等位基因變異頻率的情況表明，克隆選擇在初期移植中比在傳代擴(kuò)增中發(fā)生的更加頻繁，但具體的克隆選擇在同一類型腫瘤不同樣本中表現(xiàn)不同[25]，在某些情況下，根據(jù)基因組和轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，PDX模型的確顯示了更具轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性的跡象[26]，很可能成為腫瘤治療極為重要的目標(biāo)。在使用PDX模型進(jìn)行臨床前藥物篩選過程中，植入失敗以及建模耗時也是腫瘤治療所面臨的限制因素。此外，人體基質(zhì)和免疫細(xì)胞在移植腫瘤傳代過程中的損耗問題，將免疫功能低下小鼠體內(nèi)移植人類造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞，即建立人源化的小鼠，則有望克服這一障礙。PDX模型的另一個主要問題是小鼠體內(nèi)的人源腫瘤淋巴瘤，這種現(xiàn)象已在多種組織來源的PDX模型中被報道，其中包括非小細(xì)胞肺癌、肝癌、前列腺癌和胃癌[27-29]。

綜上，卵巢癌是復(fù)雜的異質(zhì)性腫瘤，目前對其異質(zhì)性特點了解較少，從而導(dǎo)致卵巢癌臨床診治水平的提高進(jìn)入了瓶頸階段。其主要原因是缺乏有效的卵巢癌異質(zhì)性研究平臺，而PDX模型是迄今最為有效的腫瘤異質(zhì)性研究模型，可嘗試將其應(yīng)用于卵巢癌的研究中。

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