超高效液相色譜—三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測細胞培養(yǎng)基中種色氨酸代謝物

劉悅 賈曼 崔婧 甘敏 陳剛

摘 要：為研究色氨酸在細胞水平上代謝成為吲哚乙酸、吲哚甲醛及FICZ的轉(zhuǎn)化率，本文建立了用超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜法同時檢測細胞培養(yǎng)上清中吲哚甲醛、吲哚乙酸及FICZ的方法，采用C18色譜柱、5mmol乙酸銨水及100%乙腈為流動相進行分離，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）負離子模式對3種物質(zhì)進行檢測，外標法進行定量。同時采用空白基質(zhì)加標實驗對方法的回收率及精密度進行了測量。方法線性較好，線性范圍廣，相關(guān)系數(shù)均為0.999，回收率在85%～102%之間，相對標準偏差在3.75%～8.75%之間。吲哚甲醛檢出限及定量限分別為0.5、1.5ng/mL;吲哚乙酸檢出限及定量限分別為5、10.0ng/mL;FICZ的檢出限及定量限分別為0.3、1ng/mL。該方法為研究色氨酸代謝打下基礎(chǔ)，同時也為評價高色氨酸飲食的營養(yǎng)價值提供新的思路。

關(guān)鍵詞：吲哚甲醛;吲哚乙酸;FICZ;定量檢測

色氨酸參與人體各項生理過程，調(diào)節(jié)機體的神經(jīng)系統(tǒng)及免疫功能[1-5]。色氨酸屬于必須氨基酸，維持機體正常生理功能所需的色氨酸必須依靠飲食獲得[6]，色氨酸的含量是評價蛋白質(zhì)品質(zhì)的指標之一[7]。

目前，色氨酸的生理功能主要集中在對其犬尿氨酸及血清素代謝通路的研究，對吲哚丙酮酸通路的關(guān)注度很低，但作為吲哚丙酮酸途徑的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物，吲哚甲醛、吲哚乙酸及FICZ對人體健康至關(guān)重要。一方面，攝入的色氨酸可被腸道中的微生物代謝產(chǎn)生吲哚乙酸及吲哚甲醛，調(diào)節(jié)人體細胞色素酶系統(tǒng)[8-9]，維持腸道免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定。吲哚甲醛還具有一定的抗菌活性。同時，尿液中吲哚乙酸含量的升高也被視為苯丙酮尿癥的癥狀之一[10]。色氨酸的光解產(chǎn)物6-甲酰基吲哚并[3，2-b]咔唑（FICZ）能夠誘導輔助性T細胞的增殖和分化，促進免疫系統(tǒng)活化[11]。另一方面，吲哚乙酸也是最早被發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性植物生長激素，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中已廣泛應(yīng)用于果蔬催熟及改良品質(zhì)等方面[12-13]，在植物各個器官中均有分布[12]。吲哚乙酸在可食用農(nóng)產(chǎn)品，尤其是植物性農(nóng)產(chǎn)品中的含量也與人體健康密切相關(guān)。

色氨酸存在于大多數(shù)可食用蛋白質(zhì)中，且?guī)缀醮嬖谟谒行问降闹参锏鞍字校竺住㈦u蛋及牛奶等是色氨酸的主要食物來源。因此，有必要建立一套準確、可靠的色氨酸代謝物定量方法，實現(xiàn)對人體攝入色氨酸代謝通路的研究，為評價色氨酸的營養(yǎng)價值提供新的思路。目前對吲哚乙酸的檢測方法主要有液質(zhì)聯(lián)用法、液相色譜法、離子色譜法及生物傳感器法，目標基質(zhì)大多為水果、蔬菜等植物類[16-19];對吲哚甲醛的檢測目前報道較少，主要是液質(zhì)聯(lián)用法;FICZ也普遍采用液質(zhì)聯(lián)用方法檢測[14-15，20]。為了研究色氨酸被細胞代謝為吲哚乙酸、吲哚甲醛及FICZ的轉(zhuǎn)化率，建立了利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測細胞培養(yǎng)上清中吲哚甲醛、吲哚乙酸及FICZ的方法，靈敏度高、線性范圍廣、方法簡單，為研究色氨酸的體內(nèi)外代謝提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與設(shè)備 超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜（Agilent QQQ 6470，安捷倫公司）、離心機（Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge，Thermo Fisher公司），渦旋混合儀（GENIUS 3，德國IKA公司）、電子天平（AG245，瑞士Metler Toledo公司）、0.22μm濾膜、菲洛門C18色譜柱（粒徑2.6μm，內(nèi)徑4.6 mmol，長度100 mmol）。

1.1.2 試劑 吲哚甲醛標準品（99%，Sigma）、吲哚乙酸標準品（99%，Sigma）、FICZ標準品（99%，Sigma）、甲醇（色譜純，Thermo公司）、乙腈（色譜純，Thermo公司）、純凈水（娃哈哈）、DMEM培養(yǎng)基（Invitrogen公司）、胎牛血清（Invitrogen公司）、乙酸銨（≥98%，Sigma）。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制 吲哚甲醛和吲哚乙酸用甲醇配制成濃度為1mg/mL的母液，置于-20℃冰箱中保存。FICZ標準品用DMSO溶液配制成濃度為1mg/mL的母液，置于-20℃冰箱中保存。分別取吲哚甲醛、吲哚乙酸及FICZ母液適量，用乙腈逐級稀釋為工作液。

1.2.2 色譜條件 色譜柱為菲洛門C18色譜柱（粒徑2.6μm、內(nèi)徑4.6mmol、長度100 mmol），流動相A為5mmol/L乙酸銨水，流動相B為乙腈;進樣量5μL，流速0.4mL/min，柱溫為35℃，后運行時間為2min（表1）。

1.2.3 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源負離子掃描（ESI-），多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），鞘氣溫度250℃，鞘氣流速11L/min，干燥氣溫度300℃，干燥氣流速5L/min，毛細管電壓-3 500V，霧化器壓力45psi，噴嘴電壓-500V（表2）。

2.2 檢出限及定量限

本方法以信噪比（S/N）≥3的標準品濃度為檢出限（LOD），以信噪比（S/N）≥10的標準品濃度為定量限（LOQ）。FICZ的檢出限和定量限最低，分別為0.3、1ng/mL。其次為吲哚甲醛，檢出限和定量限分別為0.5、1.5ng/mL。吲哚乙酸的檢出限和定量限分別為5、10ng/mL，為3種化合物之最高檢出限和定量限濃度（表4）。

2.3 方法準確度及精密度

分別在空白培養(yǎng)基中添加高、中、低3種不同濃度的吲哚甲醛、吲哚乙酸及FICZ溶液，使培養(yǎng)基的標準品終濃度分別為10、100、500ng/mL，每個濃度設(shè)5個平行，重復3次。將空白培養(yǎng)基及加標培養(yǎng)基按前述前處理方法處理之后上機檢測。回收率在85%～102%之間，相對標準偏差在3.75%～8.75%之間（表5）。

2.4 樣品測定

收集用普通商業(yè)DMEM培養(yǎng)基、外源添加2mmol或5mmol色氨酸的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)24h或48 h 后的293T細胞上清，對培養(yǎng)上清中的吲哚甲醛、吲哚乙酸及FICZ進行檢測，從而判定人體細胞體外代謝色氨酸產(chǎn)生吲哚甲醛、吲哚乙酸及FICZ的水平。實驗重復3次，每組2個平行。由Graphpad軟件完成方差分析，P>0.05時為差異性顯著，定量限以下視為未檢出。由表6可以看出，293T代謝色氨酸產(chǎn)生吲哚甲醛及吲哚乙酸的水平與外源色氨酸濃度及培養(yǎng)時間呈正相關(guān)，F(xiàn)ICZ在各組含量沒有顯著差異或未檢出。結(jié)果表明，色氨酸能被293T細胞在體外代謝為吲哚甲醛、吲哚乙酸，為進一步研究色氨酸的體內(nèi)吲哚丙酮酸代謝通路提供了科學依據(jù)。

3 結(jié)論

本方法樣品前處理程序簡單，操作便捷。考慮到細胞培養(yǎng)基成分相對單一，干擾雜質(zhì)較少，因此前處理采用離心后過濾的方式去除大分子蛋白或其他雜質(zhì)。本方法采用C18色譜柱分離，流動相5mmol乙酸銨水、100%乙腈實現(xiàn)了化合物的分離，峰型好、響應(yīng)高。本方法的靈敏度高、線性范圍廣、回收率高且重現(xiàn)性好，為細胞代謝色氨酸產(chǎn)生的吲哚甲醛、吲哚乙酸及FICZ定量研究打下基礎(chǔ)。◇

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