玉米染色體滴片關鍵技術及其優化

姚啟倫　李玉潔　陳發波　高健　李文博　方平　李紅艷

摘要：探討優化玉米染色體滴片關鍵因子處理效果，尋求一種操作簡單、染色體分散度和完整性好，并且適于玉米染色體分離操作的制片方法。本研究以玉米自交系B73根尖為材料，在單因素試驗的基礎上采用四因素二次回歸正交組合設計，分析玉米滴片技術中4個關鍵因子的處理效果。結果表明，NO處理時間、冰乙酸固定時間、酶解時間和滴片距離對染色體滴片效果均存在最佳處理效應?；诙位貧w方程的統計方法得到了符合實際的優化的染色體滴片技術方案，即采用NO處理時間2.0h、冰乙酸固定時間2.0h、酶解時間6.0h和滴片距離35.0cm。由此方案制作了高質量的玉米染色體制片，保證了細胞中染色體的分散性和完整性。

關鍵詞：玉米;染色體;滴片;優化

中圖分類號：S513

文獻標識碼：A

文章編號：1000-4440（2019）02-0255-07

染色體作為基因的載體，一直是細胞遺傳學和分子生物學研究的熱點。染色體制片是觀察、鑒定染色體的基本方法，它是進行生物染色體組型分析、染色體顯帶、染色體畸變分析、染色體特殊成分鑒定、DNA原位雜交和單染色體分離研究的重要技術手段。傳統的染色體制片技術是壓片法和火焰干燥法，眾多學者就染色體制片過程中的取材時間、預處理方式、冰乙酸固定時間、細胞解離及染色方法等作了大量卓有成效的研究。潘頎等以新疆紫草為材料，用壓片法研究染色體制片技術，其研究結果表明，新疆紫草染色體制片效果主要取決于秋水仙素預處理時間、處理溫度和細胞解離時間3個關鍵處理因子。勞世輝等采用火焰干燥法制備菠蘿蜜染色體制片，通過比較不同預處理試劑和預處理時間的作用效果，發現以1：1（體積比）的8-羥基喹啉（0.002mol/L）與秋水仙素（0.2%）混合液預處理制片材料，可達到理想的染色體制片效果。陳雪等通過對射干染色體壓片技術研究指出，室溫下用秋水仙素（0.1%）預處理材料8h和379C下酶解材料60min，用壓片法可制作出染色體分散良好的制片。劉丹等通過比較分析多種植物的染色體壓片技術，認為壓片法中制約植物染色體制片效果的關鍵處理因子是預處理藥劑和時間。分子生物技術的發展對染色體制片技術提出新的更高的要求，一張高質量的染色體制片要求處于有絲分裂中期相的細胞多，染色體交叉重疊少、分散性好，細胞內容物少、清晰度高。染色體滴片法是新興的一種染色體制片方法，目前國內鮮見有關染色體滴片技術研究的相關報道。為此，本試驗以遺傳學研究的模式生物一玉米為染色體制片材料，采用數理統計法分析影響染色體滴片效果的4個關鍵因子，為規范玉米染色體滴片技術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用典型玉米自交系B73作染色體制片材料，玉米自交系B73種子由長江師范學院玉米育種課題組提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 染色體滴片制作

1.2.1.1 胚根在培養皿內鋪一層無菌紗布，放入預浸6h的玉米種子，在恒溫培養箱內25C培養1～2d，待胚根長1.0～2.0cm時，剪取1.0～1.5cm根尖置入盛有超純水的EP管中，讓濕潤根尖貼于管壁。1.2.1.2 NO處理將裝有根尖的EP管放入NO處理罐，在0.5Pa的壓強下進行NO處理，NO處理罐由解壓閥、NO罐、連接管、處理罐和三通閥組成。

1.2.1.3 冰乙酸固定取出EP管并滴加適量90%冰乙酸對根尖材料進行固定處理。

1.2.1.4 材料漂洗固定后的根尖材料從EP管取出，在盛有超純水的培養皿中漂洗2～3次，然后置于載玻片切取根尖分生區。

1.2.1.5 制備細胞懸液根尖分生區材料在37C溫度下酶解，酶解后的材料用70%乙醇清洗2次，再置入瞬時離心機離心2次，每次8s，最后加入冰乙酸，搗碎混勻制成細胞懸液。

1.2.1.6 細胞懸液滴片用移液槍吸10μl細胞懸液，在一定高度依靠其自身重力直接滴加在載玻片上，待滴液干燥后進行染色處理。

1.2.1.7 鏡檢在光學顯微鏡下觀察、鑒定滴片中細胞有絲分裂中期染色體，并利用照像系統進行拍照記錄。

1.2.2 制訂染色體制片評分標準以染色體滴片效果為考察指標，根據有絲分裂中期相的細胞數、染色體重疊率、單細胞染色體數和細胞內溶物面積比4個參數值，對染色體滴片效果進行評定等級，其評分標準見表1。

1.2.3 試驗設計基于前期大量的玉米染色體滴片試驗，單因素試驗設計參照賈建的方法，按不同的試驗設計，選擇不同的NO處理時間（1.0h、1.5h、2.0h、2.5h和3.0h）、冰乙酸固定時間（1.0h、1.5h、2.0h、2.5h和3.0h）、酶解時間（5.0h、5.5h、6.0h、6.5h和7.0h）和滴片距離（10.0cm、20.0cm、30.0cm、40.0cm和50.0cm）。用二次回歸正交組合設計分析染色體滴片效果與各關鍵因子間的線性關系。單因素試驗設計得到的最優處理作為二次回歸正交設計的零水平，進行回歸正交試驗，建立染色體滴片效果與各關鍵因子的回歸方程，以探究玉米染色體滴片法的最佳技術方案。

1.3 數據分析

試驗數據經Excel整理后，利用DPS軟件進行二次回歸正交組合設計統計分析，建立回歸方程。

2 結果與分析

2.1 各關鍵因子對染色體滴片的處理效果

由表2可知，NO處理時間分別為1.0h、1.5h、2.0h、2.5h和3.0h時，玉米染色體滴片效果的得分等級分別為1、2、5、4和3，以2.0hNO處理時間的評分等級最高，染色體滴片效果最好（圖1a3）。冰乙酸固定根尖材料時間分別為1.0h、1.5h、2.0h、2.5h和3.0h時，其滴片效果的得分等級分別為1、2.5、4和3，以2.0h固定時間的染色體滴片效果最好（圖1b3），評分等級最高。酶解時間分別為5.0h、5.5h、6.0h、6.5h和7.0h時，其滴片效果的得分等級分別為3、4、5、2和1，以酶解時間為6.0h的染色體滴片效果最好（圖1c4），評分等級最高。滴片距離分別為10.0cm、20.0cm、30.0cm、40.0cm和50.0em時，其滴片效果的得分等級分別為1、3、5、4和2，以30.0cm距離的染色體滴片效果最好（圖1d3），評分等級最高。

2.2 二次回歸正交設計及回歸分析

據單因素試驗結果，二次回歸正交組合設計零水平分別為2.0h、2.0h、6.0h和30.0cm。關鍵處理因子NO處理時間的上下水平分別為1.0h和3.0h，冰乙酸固定時間的上下水平分別為1.0h和3.0h，酶解時間的上下水平分別為5.0h和7.0h，滴片距離的上下水平分別為10.0cm和50.0cm。由m=4、m，=3，選用γ=1.547，設計4個因素：NO處理時間（Z）、冰乙酸固定時間（Z2）、酶解時間（Z3）和滴片距離（Z4），相應編碼為x、x、x和x，列出因素水平編碼表（表3），將試驗設計中的編碼水平轉換成相應的實際水平，即得試驗實施方案（表4）。

據四因素二次回歸正交組合設計表，整理數據后得到四因素二次回歸正交組合設計結構矩陣及試驗結果計算表（表5），由此建立回歸方程：Y=6.18-0.25x+0.12x-0.29x+0.19x-0.30xx+0.10xx+0.06xx+0.29xx-0.03xx-0.13xx-1.47x’-1.41x'-1.45x'-1.20x'。

據表6顯著性檢驗結果，x、x、x和x，的二次項均達到極顯著水平，其余各項回歸系數均不顯著，說明x、x、x和x的二次項對試驗結果有極顯著影響，回歸關系極顯著，由此建立的數學模型與實際情況擬合較好。據平方項中心化公式：x’=x（x0）/n=x0.77，得到回歸方程：Y=10.44-0.25x+0.12x-0.29x+0.19x-0.30x₁x+0.10xx+0.06xx+0.29xx-0.03xx-0.13xx-1.47x-1.41x-1.45x-l.20x。以Y值最大為目標函數，通過確定參數x（j=1，2，3，4）的最優值。當Y值最大時，據目標函數解得x=-0.078，x=0.040，x=-0.110，x=0.360，將x=（Z-2）/0.65，x2=（Z2）/0.65，x=（Z-6）/0.65，x=（Z-30）/12.93代入得到實際因素Z=1.95，Z=2.04，Z=5.93，Z=34.65

綜上所述，根據回歸方程，優選出各關鍵處理因子的最佳方案，基于試驗操作的實際性，采用取整法，即得到本試驗玉米染色體滴片法關鍵處理因子的最佳技術方案：NO處理時間2.0h，冰乙酸固定時間2.0h，酶解時間6.0h，滴片距離35.0cm。

3 討論

3.1 影響染色體滴片效果的主要因素

滴片法的操作步驟有取材、預處理、固定、解離和滴片。材料預處理的目的是改變細胞內染色體形態及分散狀態，常采用秋水仙素、8-羥基喹啉和a-溴萘等藥劑進行化學處理，本研究對材料的預處理則是通過增壓條件下的NO處理達到改良細胞內染色體狀態的目的，同時避免了秋水仙素等化學試劑帶來的毒害和污染。材料固定的目的是使材料快速失活和蛋白質沉淀，使材料保持初始狀態，卡諾氏I固定液和甲醇冰乙酸（1：3，體積比）混合液是常用的固定液，固定液固定時間是影響染色體壓片技術的因素之一，本試驗選擇冰乙酸固定材料2h，取得了較好的效果。解離是植物染色體制片過程的重要環節，解離能分解細胞壁，消除細胞內溶物，增加染色體清晰度，解離方法有酸解法和酶解法，酸解法往往因酸解過度造成染色體損傷，目前多采用酶解法，對于酶解時間，回歸分析選優結果表明，采用2%纖維素酶和0.5%果膠酶混合液37C下酶解材料6.0h最適宜滴片法制片。不同于壓片法和火焰干燥法，滴片法的制片質量取決于滴片技術，而滴片距離直接決定染色體制片的成敗，滴片距離過小，細胞內染色體交叉重疊、分散性差，滴片距離過大則細胞內染色體過度分散、細胞間染色體混雜，回歸分析選優結果發現，細胞懸液以35.0cm的距離滴片可獲得分散性好、細胞內染色體數目完整的高質量制片。滴片法常規試驗中多采用20.0cm左右的滴片距離，35.0em的滴片距離在實際操作中可能存在滴片不準、細胞懸浮液流向邊緣導致浪費等問題。因此，在實際的試驗操作中，需綜合考慮，或反復進行滴片技術的訓練，以達到最佳的制片效果。

3.2 植物染色體制片技術

染色體制片質量是制約細胞生物學和分子生物學發展的重要因素，一張高質量的染色體制片要求細胞有絲分裂中期相多、染色體分散無重疊及染色體完整性好。目前國內外通常采用壓片法和低滲涂片法進行染色體制片。染色體壓片技術作為常用的染色體制片方法，被廣泛應用于各類生物，尤其是植物染色體研究。壓片法雖然操作簡單實用，但需要適宜的取材時間和嫻熟的壓片技術，對操作者的操作技術要求較高。染色體低滲涂片技術的核心是將試驗材料均勻涂布在載玻片，上，從而有效降低壓片法所造成的染色體重疊。低滲涂片法盡管對操作技術要求不高，且制片效果較好，但其操作過程涉及火焰干燥和蓋玻片壓片，從而影響染色體完整性。染色體滴片法是將處理后的試驗材料搗碎于冰醋酸溶液，然后制成細胞懸液，細胞懸液利用自身重力滴落在玻片上，保證了細胞中染色體的分散性和完整性。滴片法是一種新的染色體制片方法，目前國內尚未見有關滴片技術研究的相關報道，鑒于滴片法的技術優勢，它將廣泛應用于染色體研究，進而促進細胞遺傳學和分子生物學的發展。為規范染色體滴片技術，本研究基于前期的染色體滴片技術經驗，通過設置染色體滴片技術關鍵處理因子，采用回歸分析模型，確立了最佳玉米染色體滴片技術方案。由此制作了高質量的染色體制片，制片中細胞有絲分裂中期相多、細胞內溶物和雜質少、染色體著色均勻、染色體交叉重疊少、具有完整染色體組（2n=20）的細胞較多。

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