不同凍結方式對中華絨螯蟹蟹肉品質的影響

邵俊杰　朱昱璇　黃鴻兵　張世勇　潘建林　萬金娟　陳風蔚　尹思慧　張美琴　付龍龍　馬昊

摘要：為探究凍結方式對中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）蟹肉生化特性和感官品質的影響，以鮮活中華絨螯蟹為原料，分別進行-20℃、-40℃、-70℃、液氮速凍處理，之后于20℃條件下儲藏180d，分析中華絨鰲蟹感官特性、pH值、失水率、丙二醛含量鹽溶性蛋白質含量、總巰基含量和Ca2+-ATPase活性等指標的變化趨勢。結果表明，隨著凍藏時間的延長，中華絨螯蟹蟹肉的pH值降低，失水率增大，鹽溶性蛋白質含量降低，丙二醛含量增大，總巰基含量降低，Ca2+-ATPase活性下降。中華絨螯蟹肌原纖維蛋白的變性程度與凍結方式密切相關。凍結溫度越低，凍藏期內蟹肉各指標數值變化越小，蛋白質完整度和感官接受度越高，與新鮮蟹肉品質越接近。與-20℃、-40℃、-70℃速凍處理相比，液氮速凍能更好地減緩蟹肉蛋白質變性和脂肪氧化，能最大限度地保持蟹肉感官品質，是最佳的速凍工藝。

關鍵詞：中華絨螯蟹;凍結方式;感官品質;生化特性

中圖分類號：TS254.4

文獻標識碼：A

文章編號：1000-4440（2019）02-0429-07

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis），又稱河蟹、大閘蟹、螃蟹，是中國特有的、經濟價值較高的名貴水產品。中華絨螯蟹因其肉質細嫩，蛋白質含量高，不飽和脂肪酸種類豐富，富含鈣、磷、鐵、鋅、銅、糖類、蟹黃素、蟹紅素等營養物質[1-2]，深受消費者歡迎。近年來，中國中華絨螯蟹養殖業發展迅速，現已成為特種水產品中最具影響力的產業之一。中華絨螯蟹是季節性非常強的水產品，上市時間集中，只有在每年固定的時間節點，中華絨螯蟹才能膏滿黃肥。因此，為防止市場上因中華絨螯蟹積壓而出現腐敗變質問題，同時保證中華絨螯蟹能夠全年供應，滿足出口需求，中華絨螯蟹的凍藏加工技術研究已迫在眉睫。

凍藏是現在最普遍和最有效的農產品保藏方法，對水產品貯藏、運輸和加工意義重大[34]。冷凍處理能夠抑制微生物生長和內源酶作用，延長產品貨架期，但也會造成蛋白質變性和脂肪氧化，改變肌肉的結構特性、保水性、風味等品質特性，對產品銷售和食用產生負面影響[57]。有研究者發現，肌肉品質變化與凍結方式有緊密聯系[4，8]。因此，研究凍結方式對中華絨螯蟹蟹肉生化特性的影響、篩選最佳凍藏工藝對蟹肉品質提升十分必要。

目前，低溫凍結技術針對的水產品主要是海水魚[9-10]、蝦等，關于中華絨螯蟹凍藏工藝的報道較少。因此，本研究通過測定凍藏期內中華絨螯蟹肌肉感官特性、pH值、失水率、丙二醛（Malondialde-hyde，MDA）含量、鹽溶性蛋白質含量、總巰基含量、Ca2+-ATPase活性等指標，分析不同凍結方式對中華絨螯蟹蟹肉品質的影響，為中華絨螯蟹原料加工利用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活雄性中華絨螯蟹由宿遷市成子湖食品有限公司提供，體質量為（140+15）g，江蘇省淡水水產

研究所鑒定為中華絨螯蟹。

MDA測定試劑盒、Ca2+-ATP酶活性試劑盒購自南京建成生物工程研究所，其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

DW-225低溫試驗箱，南京泰斯特試驗設備有限公司產品;C-MAG HS7數顯加熱磁力攪拌器、U1-tra Turrax T-25 Basic高速勻漿機，德國IKA公司產品;211 pH計，意大利Hanna公司產品;Kjeltec'M2300全自動凱氏定氮儀，瑞典FOSS公司產品;M2e酶標儀，美國MD公司產品;Beckman Avanti J-A和AR64離心機，美國Beckman Coulter公司產品;ZKSY-600水浴鍋，南京科爾儀器設備有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 中華絨螯蟹凍結和貯藏

將鮮活中華絨螯蟹用水沖洗干凈并瀝干，然后進行如下凍結處理。①快速凍結：將中華絨螯蟹分別放入-20℃、-40℃、-70℃的低溫試驗箱中速凍，直至中華絨螯蟹腹部中心溫度達到-20℃，所用時間依次為185min、136 min和45 min;②液氮速凍：將中華絨螯蟹浸沒于液氮中直至中心溫度達到-209C，所用時間為90s。將凍結完成的中華絨螯蟹置于保鮮盒中密封，在-20℃下儲藏。

1.3.2 取樣

定期（0d、30d.90d、180d）取樣，將凍藏中華絨螯蟹置于4℃冰箱中解凍。解凍完成后，除去中華絨螯蟹中的不可食部分，取中華絨螯蟹腹部肌肉進行指標測定。

1.3.3 感官評價

由經過訓練的10名感官評定員采用盲評計分方式分別從色澤、氣味、質地3個方面對中華絨螯蟹進行評分，各指標的感官評價分值控制在0～9范圍內，0分代表品質最差，9分代表品質最佳。每名感官評定員根據評定標準（表1）對中華絨螯蟹品質進行評分，取其平均值作為最終評定結果。

1.3.4 pH 的測定

將5 g蟹肉與45 ml水混合，勻漿，10000g離心15 min，測定pH。

1.3.5 失水率的測定

參照楊利艷等[12]的方法，略有改動。將凍藏的中華絨螯蟹在4℃下解凍12 h，用濾紙拭去表面水分并瀝干，稱質量。計算失水率，失水率=[（速凍前質量-速凍后質量）/速凍前質量]x100%。

1.3.6 鹽溶性蛋白質的提取和測定

參照陰曉菲等[13]的方法提取鹽溶性蛋白質。鹽溶性蛋白質含量的測定采用雙縮脲法。

1.3.7 MDA含量的測定

參照吳慶元等[14]的方法，略有改動。取一定量蟹肉，加入5倍體積去離子水，10000 r/min勻漿1 min，用于丙二醛含量的測定。用MDA測定試劑盒測定MDA含量。

1.3.8 Ca2+-ATPase活性的測定

使用超微量Ca2+-ATP酶活性試劑盒測定蟹肉Ca2+-ATPase活性。

1.3.9 總巰基（SH）含量的測定

參照彭歡歡等[15]和魯耀彬等[16]的方法。取方法1.3.6 中提取的1 ml肌原纖維蛋白質（4 mg/ml），加入9.0 ml 0.2 mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液（含有8 mol/L脲，2%十二烷基硫酸鈉和10mmol/L乙二胺四乙酸，pH6.8）混合，取4 ml混合液，加入0.4 ml0.1% 5，5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB），40℃水浴25min，在412 nm波長處測吸光值，用0.6 mol/L KCl（pH 7.0）溶液作為空白對照。計算總SH含量，SH含量=[（AXn）/（cxM）]x106，式中，A為412 nm處的吸光值，n為稀釋倍數，c為摩爾吸光系數[其值為13600mol/（L.em）]，M為肌原纖維蛋白質量濃度（mg/ml）。

1.4 數據分析

用SAS（Statistics analysis system，Version 8.12）軟件進行統計分析，方差分析采用ANOVA（Analy-sis of variance）分析，多重比較采用Duncan multiple-arrage test，差異顯著性為P<0.05。

2 結果

2.1 凍結方式對中華絨螯蟹肌肉感官品質的影響

各冷凍處理的中華絨鰲蟹蟹肉感官指標評分均低于新鮮對照（表2），說明經過冷凍處理后，蟹肉的感官品質均下降。不同凍結方式對中華絨螯蟹肌肉的色澤、質地有顯著影響（P<0.05），但對氣味的影響較小;凍結溫度越高，凍藏時間越長，肌肉色澤變化越明顯，質地尤其是彈性越差。在相同儲藏時間內，液氮速凍處理的蟹肉各項感官評分較高，與新鮮對照較為接近，其次是-70°C處理、-40℃處理和-20℃處理。以上結果說明，相同儲藏條件下，凍結方式對蟹肉感官特性有顯著影響。

2.2 凍結方式對中華絨螯蟹pH的影響

中華絨螯蟹適合生長在pH7～9的水環境中，本試驗所用中華絨螯蟹的pH值為8.13左右。在凍藏過程中，各處理的pH值均呈下降趨勢（圖1）。-20℃和-40℃處理的pH值在凍藏初期下降明顯，90d后pH值開始上升，并且-20℃處理的，上升速度高于-40℃處理。液氮處理的pH值變化最為平緩，其次是-70℃處理，180d后pH值分別為7.58和7.46，兩處理在儲藏90d后都沒有出現明顯的pH值上升的現象。

2.3 凍結方式對中華絨螯蟹失水率的影響

在凍結過程中，中華絨螯蟹內部形成大量的冰晶，細胞膜滲透壓改變，細胞結構和組織破裂，解凍后冰晶融化，自由水和一部分結合水流失，最終導致汁液和營養物質流失。不同凍結方式下中華絨螯蟹失水率隨著儲藏時間的延長呈明顯增加的趨勢，各處理間差異顯著（圖2）。-20℃、-40℃、-70℃和液氮處理在儲藏180d后，失水率由最初的1.06%分別上升到3.26%、2.81%、2.24%和1.81%，分別增加了2.08倍、1.65倍、1.11倍和0.71倍。因此，凍結溫度越低，解凍后蟹肉失水率越低，持水力越高。

2.4 凍結方式對中華絨螯蟹脂肪氧化的影響

中華絨螯蟹蟹肉中不飽和脂肪酸含量占總脂肪含量的70%以上，油酸C18：1w9作為評價肉品質的重要指標之一，含量最高（22.39%～30.10%）[17]。由于蟹肉中不飽和脂肪酸含量高，因此在低溫條件下也會發生氧化，對產品品質和貨架期產生負面影響[8]。中華絨螯蟹初始MDA含量很低，約為0.29mg/kg（圖3）。-20℃處理的MDA含量在貯藏前90d內持續快速上升，在90d時達到峰值（0.55mg/kg），隨后緩慢降低。-40℃、-70℃和液氮處理的MDA含量變化較一致，在180d的貯藏期內均是持續增大。液氮處理的MDA含量最低（0.45 mg/kg），較凍藏初期僅增加了55%。

2.5 凍結方式對中華絨螯蟹鹽溶性蛋白質含量的影響

鹽溶性蛋白質，即肌原纖維蛋白質，是肌肉蛋白質的主要組成部分，對蟹肉品質起到關鍵作用。各處理的鹽溶性蛋白質含量在前90d快速降低，隨后下降速度減慢（圖4）。速凍溫度越高，蟹肉鹽溶性蛋白質含量下降越明顯。-20℃、-40℃、-70℃和液氮速凍處理在凍藏180d后，鹽溶性蛋白質含量由最初的36.11 mg/g分別下降到14.03 mg/g.18.36 mg/g、22.69 mg/g、25.97 mg/g，分別下降了61.15%、49.16% 37.16%、28.08%。

2.6 凍結方式對中華絨螯蟹肌原纖維蛋白質總巰基含量的影響

巰基是肌原纖維蛋白質中活性最強的功能基團，在凍藏期間巰基易被氧化形成二硫鍵，導致巰基含量降低。凍藏前30d，各處理的總巰基含量下降速度較快，隨后下降速度減緩。凍藏180d后，-20℃、-40℃、-70℃、液氮速凍處理的總巰基含量分別降低到初始值的52.71%、60.24%、65.36%、69.58%，說明在相同凍藏條件下，凍結方式對巰基氧化程度有顯著影響，凍結溫度越低，總巰基含量越高（圖5）。

2.7 凍結方式對中華絨螯蟹Ca2+-ATPase活性的影響

各處理的Ca2+-ATPase活性在前90d降低明顯，隨后持續下降，但速度略有減慢（圖6）。-20℃處理的降幅最大，180d凍藏期結束時剩余Ca2+-AT-Pase活性[0.57 μumol/（mg·min）]僅為新鮮樣品的30.32%;其次是-40℃、-70°C處理，殘留Ca2+-AT-Pase活性分別為0.81 μmol/（mg·min）和1.00μmol/（mg·min）;液氮速凍處理的下降趨勢最為平緩，180d儲藏期結束時，殘留活性為1.18μmol（mg·min），為新鮮樣品的62.77%。因此，凍結溫度越低，Ca2+-ATPase活性越高。

3 討論

水產動物停止呼吸后，體內糖原生成乳酸，導致肌肉pH值下降。但是，微生物代謝、蛋白質及其他含氮物質降解生成氨及胺類等堿性物質，又使肌肉pH值升高[19]。因此，pH值是評價肌肉新鮮度的重要參考指標。凍藏初期，中華絨螯蟹體內糖原生成乳酸，所有處理的pH值呈下降趨勢。凍藏90d后，-20℃和-40℃處理的中華絨螯蟹體內出現微生物代謝活動，以及蛋白質在內源性組織蛋白酶作用下發生降解，生成堿性物質，pH值升高。-70℃和液氮處理在凍藏后期沒有出現pH值明顯升高的現象，說明超低溫速凍能有效地抑制微生物生長，減緩蛋白質降解。屠冰心等[20]在研究低溫冷凍對大黃魚凍藏品質影響的過程中也發現，大黃魚肌肉在凍藏過程中pH值總體呈先下降后上升的趨勢。楊利艷等[12]認為液氮速凍的凡納濱對蝦pH值與新鮮的凡納濱對蝦最為接近，并且凍結溫度越高，pH值越低。

中華絨鰲蟹體內液體流失主要是因為在凍結過程中冰晶的形成破壞了肌肉組織和細胞結構，而冰晶的形成與凍結時間有顯著的相關性[15-16]。一般來說，0℃至-5℃的降溫過程為最大冰晶生成帶。在此期間，細胞外水分率先結晶，導致細胞外溶液離子濃度增大，造成細胞內溶液外移，繼而形成更大的冰晶。冰晶擠壓細胞，使細胞破裂，肌肉組織結構也被破壞，造成解凍后汁液流失增多。同時，蛋白質分子失去結合水，發生凝集，導致變性，最終引起肌肉品質下降[12]。因此，在凍結過程中，通過最大冰晶生成帶所需要的時間越短，水產品體內形成的冰晶越小，對肌肉組織的破壞越小，產品品質越高。本試驗中，與-20℃、-40℃和-70℃處理相比，液氮處理的溫度極低，可以在最短的時間內通過最大冰晶生成帶，使中華絨螯蟹中心溫度在90s內達到-20℃，細胞內水分子來不及移動便形成了數量多且分布均勻的小冰晶，明顯減弱了對組織結構的破壞，避免了大量蛋白質變性和營養成分的流失。本研究結果與楊利艷等[12]和Goncalves等[21]的報道一致，液氮速凍能夠顯著減少水產品的失水率，更好地保持產品風味和營養。隨著凍藏時間的延長，4種凍結方式的失水率不斷增大，原因是在凍藏期間，冰晶體積增大，加大了對肌纖維結構的破壞，更多的結合水轉化為自由水門。

MDA是脂質過氧化作用的產物，其含量越高，說明脂肪氧化程度越高，酸敗就越嚴重。MDA也是一種致癌物質[22-23]，所以MDA含量不僅能夠作為水產品中脂肪酸敗程度的評價指標，還能反映其食用安全性。在凍藏過程中，蟹肉中自由水含量減少，組織間隙液濃度增大，易導致脂肪氧化速度加快。本研究中，-20℃處理的MDA含量在90d時達到峰值，隨后緩慢降低，原因可能是氧化產物醛、酮進一步降解，與蛋白質分解產物發生相互作用。MDA能與魚肉中的氨基反應生產1-氨基-3-氨基丙烯，導致MDA含量下降[24]。彭歡歡等[15]研究發現，-20C速凍蟹肉貯藏12周時MDA含量達到最大值，之后MDA含量降低。-40℃、-70℃和液氮處理的MDA含量平穩上升，說明超低溫速凍處理能夠延緩蟹肉脂肪氧化，避免二級氧化產物的再次降解。

在中華絨螯蟹速凍過程中，蛋白質的部分結合水形成冰晶，使蛋白質分子間形成非共價鍵，進而形成不溶性大分子聚集體，導致蛋白質溶解性下降[25]。另外，巰基氧化后形成的二硫鍵會導致肌球蛋白重鏈聚合，引起蛋白質溶解性、營養品質下降[15-26]。從本試驗結果中發現，在不同凍結方式下，中華絨螯蟹鹽溶性蛋白質含量的下降趨勢與總巰基含量的變化趨勢存在明顯相關性。說明中華絨螯蟹鹽溶性蛋白質含量的下降在很大程度上是由巰基氧化形成二硫鍵所引起的。

蛋白質巰基活性較高，且對氧化反應比較敏感，因此巰基含量變化可以用于表征蛋白質氧化的程度。由于冰晶的形成，導致肌動球蛋白分子間的引力增強，但蛋白質分子與水分子的相互作用減弱，造成蛋白質空間結構發生明顯變化，使埋藏在蛋白質分子內部的疏基暴露出來，進而被氧化成二硫鍵，引起疏基含量降低[2]。因此，速凍方式對巰基含量變化的影響極其顯著。彭歡歡等[15]和陰曉菲等[13]分別研究了凍結方式對中華絨螯蟹和草魚生化特性的影響，發現-60℃、-40℃凍結樣品比-20℃凍結樣品具有更高的鹽溶性蛋白質和巰基含量，表明凍結溫度越低，形成的冰晶越小，對肌原纖維蛋白質結構的破壞越小，這與本試驗結果一致。本研究中各處理的巰基含量在前30d下降較快，可能是因為蛋白質分子外側有大量的巰基，而這部分巰基在肌原纖維蛋白質不變性的情況下就能在儲藏初期率先發生氧化。

Ca2+-ATPase活性源于肌球蛋白頭部結構，是反應肌球蛋白完整性的重要參數[28]。凍藏期Ca2+-ATPase活性越高，則肌球蛋白的完整性越高，變性程度越低，肉品品質越高[2930]。在超低溫凍結過程中，由于冰晶的形成伴隨著肌肉中鹽分濃縮，離子強度增加，致使肌球蛋白頭部構象發生變化，進而使Ca2+-ATPase活性降低[31]。蛋白質分子間相互作用的增強導致蛋白質分子發生重排，肌球蛋白活性部位的巰基氧化也可能引起Ca2+-ATPase活性降低[13，32-33]。此外，凍藏期間肌球蛋白分子發生聚合，頭部結構被掩蓋，與ATP接觸概率降低，催化ATP脫磷反應的活性也同時降低[34]。王陽光等[35]在研究速東方式對梭子蟹儲藏期理化性質的影響中也發現，速凍溫度越低，Ca2+-ATPase活性下降速度越慢。這與本研究結果一致，表明液氮速凍能更好地降低蟹肉蛋白質的變性程度。

綜上所述，凍結方式對中華絨螯蟹蟹肉生化特性和感官品質有顯著影響。更低的凍結溫度能更有效地減緩蛋白質變性和脂肪氧化。與-20℃、-40℃和-70℃速凍處理相比，液氮速凍方式可以最大限度地保持中華絨螯蟹蟹肉的品質，特別適用于中華絨螯蟹的儲藏、運輸和加工。

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