外源生長激素對水稻T-DNA插入突變體褐飛虱抗性的影響及其農藝性狀測定

舒宛 王心怡 李志華 等

摘要：【目的】分析外源生長激素對水稻T-DNA插入突變體褐飛虱抗性的影響，并測定其農藝性狀，為突變基因介導的抗蟲分子機理研究提供理論參考。【方法】以水稻受體中花11（ZH11）及其T-DNA插入突變體CF54為材料，利用三引物PCR鑒定出純合突變株系，并用乙烯利（ET）、水楊酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）對ZH11及其純合突變株系進行處理，測定植株上褐飛虱的蜜露分泌量和蟲體增重量。對ZH11及其純合突變株系的株高、穗長、有效穗數、有效分蘗數、每穗實粒數和千粒重等農藝性狀進行測定。【結果】從突變體CF54后代中共篩選出10個株系，其中純合突變株系有2個，分別為CF54-6和CF54-10。經ET、SA和MeJA處理后ZH11及其純合突變株系CF54-6和CF54-10植株上褐飛虱的蟲體增重量和蜜露分泌量較未處理對照顯著（P<0.05，下同）或極顯著（P<0.01，下同）下降，但未處理對照間均無顯著差異（P>0.05，下同）。經MeJA處理后，純合突變株系CF54-6和CF54-10植株上褐飛虱的蟲體增重量和蜜露分泌量較ZH11顯著下降，但經SA和ET處理的純合突變株系CF54-6和CF54-10植株上褐飛虱的蜜露分泌量和蟲體增重量與ZH11無顯著差異。純合突變株系CF54-6和CF54-10的有效分蘗數、有效穗數和千粒重與ZH11無顯著差異，但株高、穗長和每穗實粒數顯著或極顯著高于ZH11。【結論】ET、SA和MeJA 3種外源生長激素均能誘導水稻野生型及其純合突變株系植株對褐飛虱的取食與生長發(fā)育產生抑制作用，尤其是MeJA抑制效果最佳，推測純合突變株系抗蟲性受茉莉酸（JA）信號途徑的影響更大。T-DNA插入明顯影響水稻植株的農藝性狀。

關鍵詞： 水稻;T-DNA插入突變體;褐飛虱;抗性;茉莉酸甲酯（MeJA）;乙烯利（ET）;水楊酸（SA）;農藝性狀

中圖分類號： S511.035.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）02-0230-07

Abstract：【Objective】The purpose was to identify the effect of growth hormone treatment on brown planthopper （BPH） resistance of rice T-DNA insertion mutants， and to detect the agronomic traits of the mutants，which could provide theoretical reference for the study of molecular mechanism of insect resistance mediated by mutant gene. 【Method】 Rice variety Zhonghua 11（ZH11） and its T-DNA insertion mutant CF54 were used as materials. Homozygous insertion mutants were identified by the tri-primers PCR method. ZH11 and its homozygous mutant were treated with ethephon（ET），salicylic acid（SA） and methyl jasmonate（MeJA）to measure the BPH honeydew secretion and the weight gain. Finally，agronomic traits，such as the plant height，spike length，effective spikes，number of productive panicles，grain number per spike and 1000-grain weight of ZH11 and the mutants were measured. 【Result】Ten lines were screened out from the offspring of mutant CF54，including two homozygous mutant lines CF54-6 and CF54-10. After ET，SA or MeJA treatments，the body weight gain and honeydew secretion of ZH11 and its homozygous mutant strains CF54-6 and CF54-10 on plants were significantly（P<0.05，the same below） or extremely（P<0.01，the same below） lower than those of untreated control，but no significant difference was detected between untreated controls（P>0.05， the same below）. After treated with MeJA，the homozygous mutant lines CF54-6 and CF54-10 displayed significant reduction in BPH honeydew secretion and the weight gain comparing with ZH11. However，there was no significant difference in honeydew secretion and body weight gain between homozygous mutants CF54-6 and CF54-10 treated with SA and ET and ZH11. The productive panicles，effective spikes and 1000-grain weight of homozygous mutant lines CF54-6 and CF54-10 treated by SA and ET were not significantly different from those of ZH11. But the plant height，spike length，and grain number per spike increased significantly or extremely higher than? ZH11. 【Conclusion】The three exogenous growth hormones ET，SA and MeJA can induce the inhibition of feeding and growth of BPH in wild type rice and homozygous mutant rice plants，the effects of MeJA is the optimal. It is speculated that the resistance of these two mutant lines are more affected by jasmonic acid（JA） signaling pathway. T-DNA insertion affects the agronomic traits of rice plants.

Key words： rice; T-DNA insertion mutant; Nilaparvata lugens; resistance; methyl jasmonate（MeJA）; ethephon （ET）; salicylic acid（SA）; agronomic trait

0 引言

【研究意義】水稻（Oryza sativa L.）是我國的第一大糧食作物，而褐飛虱（Nilaparvata lugens）是造成水稻受害減產的最主要害蟲之一（王慧等，2016）。實踐表明，抗蟲水稻品種的選育是防治褐飛虱最高效、無污染的方法，構建水稻突變體庫為水稻功能基因組研究及其品種選育提供了重要資源（Meng et al.，2017）。因此，考察水稻相關突變體對褐飛虱的抗性，并對其農藝性狀進行測定，可為抗褐飛虱新基因的發(fā)掘及新品種選育提供參考依據。【前人研究進展】目前，從水稻中發(fā)現(xiàn)并被定位的抗褐飛虱基因有35個（Wang et al.，2018），成功克隆的抗性主效基因有8個，如Bph3、Bph6、Bph9、Bphl4和Bph26等（Du et al.，2009;Liu et al.，2014;Srinivasan et al.，2015;Zhao et al.，2016;Guo et al.，2018），其可有效提高水稻對褐飛虱的抗性。但利用這些抗性基因通過分子標記育種等手段培育抗褐飛虱水稻的周期相對較長，且大多數抗性品種只含有單個或少數抗褐飛虱基因，可能較難應對褐飛虱生物型變異的發(fā)生，導致水稻品種對褐飛虱的抗性逐漸下降（王海鵬等，2016）。隨著反向遺傳學技術的發(fā)展，利用其鑒定抗性相關基因可加快對抗蟲相關基因功能及其分子機理研究，從而促進水稻抗蟲育種。姚張良等（2014）構建了水稻OsRCI-1基因的RNAi表達載體并獲得突變株系ir-rci，通過對褐飛虱生物量（初羽化體重）、發(fā)育歷期、羽化數、單雌卵量和長翅型比率等多個生長發(fā)育指標的測定，結果表明，OsRCI-1基因功能沉默后水稻對褐飛虱的抗性顯著增強。郭惠民（2015）以水稻T-DNA插入突變體為研究對象，通過田間觀察從11000多份純合突變體中獲得259份抗褐飛虱的突變體，并通過室內抗蟲實驗篩選出1個高抗褐飛虱的突變體T35。此外，有研究發(fā)現(xiàn)外源生長激素處理對褐飛虱與水稻間的互作起著重要作用。吳瑩瑩等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，用0.25和0.50 mmol/L茉莉酸甲酯（MeJA）處理水稻品種IR26、IR36和TN1后，水稻植株對褐飛虱II生物型的抗性顯著提高，由感蟲水平上升至抗蟲水平。Guo等（2018）使用外源水楊酸（SA）和茉莉酸（JA）處理感褐飛虱水稻和攜帶Bph6基因的抗褐飛虱水稻，結果發(fā)現(xiàn)，褐飛虱的存活率明顯降低，水稻植株對褐飛虱的抗性增強。【本研究切入點】目前鮮見以蜜露分泌量和蟲體增重量為抗蟲指標探討不同外源生長激素處理對水稻突變體抗褐飛虱性影響的相關研究報道。【擬解決的關鍵問題】以水稻T-DNA插入突變體為材料，利用乙烯利（ET）、SA和MeJA對其進行處理，以蜜露分泌量和蟲體增重量為抗蟲指標鑒定突變體植株對褐飛虱的抗性水平，分析突變體中突變基因介導的抗性所參與的信號通路，為該基因介導的抗蟲分子機理研究提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試的水稻受體中花11（ZH11）及其T-DNA插入突變體CF54來源于華中農業(yè)大學突變體庫;褐飛虱蟲源來源于廣西大學農場實驗田并在感蟲品種臺中本地1號（TN1）上飼養(yǎng)并繁殖;SA購自索萊寶（北京）科技有限公司;MeJA購自麥克林（上海）生化科技有限公司;ET購自美國Sigma-Aldrich公司。

1. 2 純合突變體的鑒定

參照張斌和何福林（2017）的三引物PCR從水稻T-DNA插入突變體CF54中鑒定獲得純合突變株系。依據T-DNA插入位點，F(xiàn)P為插入位點上游基因序列上的正向引物，RP為插入位點下游基因序列上的反向引物，NP為T-DNA左端側翼序列上的中間引物（表1）。PCR反應體系10.0 μL：2×Taq Master Mix 5.0 μL，正、反向引物（FP和RP）各0.2 μL，NP中間引物（載體上引物）0.4 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O補足至10.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，進行32個循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR產物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1. 3 生長激素處理

SA、MeJA和ET供試濃度分別為0.5、1.0和0.5 mmol/L（魯玉杰等，2006;吳瑩瑩等，2012）。其中SA和MeJA以50 mmol/L Na2HPO4緩沖液（用1 mol/L鹽酸滴定至pH 8.0）為溶劑;ET以蒸餾水（pH 7.2）為溶劑。

參照魯玉杰等（2006）的方法：取苗齡30 d的盆栽（直徑25 cm，高度15 cm）水稻苗（4株/盆）共45盆180株，處理前1 d洗凈植株莖稈，然后分別用SA、MeJA和ET噴灑植株，分別以50 mmol/L Na2HPO4緩沖液和蒸餾水為對照，按5 mL/株的劑量處理。將處理后的水稻植株置于環(huán)境條件為溫度（28±2）℃、光照/黑暗為12 h/12 h、相對濕度70%～80%的溫室內培養(yǎng)24 h，然后進行接蟲處理試驗。

1. 4 蜜露量和蟲體增重量測定

水稻植株經生長激素處理24 h后，將Parafilm蠟膜制作的蠟袋（30 mm×35 mm）固定在水稻莖稈中間部位（圖1），內接1頭將在24 h內羽化的褐飛虱雌成蟲，48 h后終止褐飛虱取食，取下蠟袋。按照每株接種2個蠟袋，每盆接8個蠟袋，每盆苗中取1株苗固定2個未接蟲的蠟袋作對照，每處理設3盆，即以上試驗均3個重復。使用十萬分之一精度天平分別稱量褐飛虱取食前后的蠟袋重量和蟲體重量（鄧釗等，2016）。蜜露分泌量為褐飛虱取食前后蠟袋的重量差，蟲體增重量為褐飛虱取食前后蟲體重量差。以蟲體增重量和蜜露分泌量的平均值來綜合評定水稻植株對褐飛虱的抗性水平。

1. 5 農藝性狀測定

2017年秋季將ZH11及篩選獲得的純合突變體株系種植于廣西大學試驗田，并在成熟期對其進行農藝性狀測定，包括株高、穗長、有效穗數、有效分蘗數、每穗實粒數和千粒重。每個株系在田間種植10行，每行10株，設3個重復。每個重復兩端的株行和每行兩端的單株均不統(tǒng)計農藝性狀。采用Excel 2007和SPSS 18.0進行數據統(tǒng)計分析及制圖。

2 結果與分析

2. 1 純合突變株系的鑒定結果

根據三引物PCR篩選純合突變體株系。具體過程：FP與RP引物間因T-DNA插入導致該組合無法擴增出目標條帶，僅FP與NP組合能擴增出大小為508 bp的單一條帶;而未插入T-DNA的陰性植株中，F(xiàn)P與RP組合可擴增出大小為914 bp的單一條帶;雜合插入突變體中，一條染色體上有T-DNA插入，F(xiàn)P與NP組合可擴增出大小為508 bp的條帶，而另一條染色體無T-DNA插入，F(xiàn)P也可與RP組合擴增出大小為914 bp的條帶。利用該方法從突變體CF54后代中共篩選出10個株系，其中純合突變株系2個，分別為CF54-6和CF54-10，雜合突變株系有5個，無突變的株系有2個，另外一個株系無法判斷（圖2）。

基于突變體庫中提供的信息，利用突變體CF54的側翼序列（962 bp）在NCBI中進行BLAST比對，結果發(fā)現(xiàn)，T-DNA的插入位點在水稻第7染色體上，位于Os07g44710基因下游9.94 kb和Os07g44730基因上游2.02 kb的基因間隔區(qū)域，并未插入有注釋功能的基因內部（圖3）。其中，Os07g44710基因的注釋功能為鈣調素依賴性蛋白激酶，而Os07g44730基因的注釋功能為未知蛋白。由于突變體CF54中T-DNA插入在基因間隔區(qū)域，無法從插入位點的信息推測是否由于突變而導致性狀改變。

2. 2 MeJA處理對褐飛虱蜜露分泌量和蟲體增重的影響

經MeJA處理的ZH11及其純合突變株系CF54-6和CF54-10植株上褐飛虱的蜜露分泌量和蟲體增重均存在顯著差異（P<0.05，下同），較未處理對照均顯著或極顯著（P<0.01，下同）降低，未處理對照間無顯著差異（P>0.05，下同）（圖4）。其中，經MeJA處理的純合突變株系CF54-6和CF54-10植株上褐飛虱蜜露分泌量分別為2.06和2.22 mg，較對應的對照極顯著降低52.5%和51.2%，比MeJA處理的ZH11顯著降低35.4%和30.4%（圖4-A）。經MeJA處理的純合突變株系CF54-6和CF54-10植株上褐飛虱蟲體增重量分別為0.31和0.33 mg，較對應的對照極顯著降低61.3%和60.7%，比MeJA處理的ZH11顯著降低44.6%和41.1%（圖4-B）。綜上所述，在MeJA誘導作用下，ZH11及其純合突變株系植株上褐飛虱的取食受到抑制，生長發(fā)育延緩，尤其對純合突變株系植株上褐飛虱的生長發(fā)育影響更明顯。

2. 3 SA處理對褐飛虱蜜露分泌量和蟲體增重的影響

經SA處理的ZH11與其純合突變株系CF54-6和CF54-10植株上褐飛虱的蜜露分泌量和蟲體增重量均無顯著差異，但較未處理對照均顯著降低，未處理對照間也無顯著差異（圖5）。其中，經SA處理的ZH11及其純合突變株系CF54-6和CF54-10植株上褐飛虱的蜜露分泌量分別為3.15、2.93和3.02 mg，較對應的對照顯著降低31.5%、32.5%和33.6%（圖5-A）。經SA處理的ZH11及其純合突變株系CF54-6和CF54-10植株上褐飛虱的蟲體增重量分別為0.55、0.51和0.49 mg，較對應的對照顯著降低34.5%、36.3%和41.0%（圖5-B）。綜上所述，在SA誘導作用下，ZH11及其純合突變株系植株上褐飛虱的取食均受到抑制，生長發(fā)育延緩。

2. 4 ET處理對褐飛虱蜜露分泌量和蟲體增重的影響

經ET處理的ZH11及其純合突變株系CF54-6和CF54-10植株上褐飛虱的蜜露分泌量和蟲體增重量變化情況與SA處理相似（圖6）。其中，經ET處理的ZH11及其純合突變株系CF54-6和CF54-10植株上褐飛虱的蜜露分泌量分別為3.08、3.25和3.19 mg，較對應對照顯著降低34.9%、31.9%和31.7%（圖6-A）。經ET處理的ZH11及其純合突變株系CF54-6和CF54-10植株上褐飛虱的蟲體增重量分別為0.57、0.53和0.58 mg，較對應的對照顯著降低36.0%、36.1%和31.8%（圖6-B）。綜上所述，在ET誘導作用下，ZH11及其純合突變株系植株上褐飛虱的取食受到抑制，生長發(fā)育延緩。

2. 5 農藝性狀測定結果

對篩選出的純合突變株系CF54-6和CF54-10農藝性狀進行測定，結果如表3所示。2個純合突變株系的有效分蘗數、有效穗數和千粒重與ZH11無顯著差異，其中，CF54-6和CF54-10的有效穗數均高于ZH11，但有效分蘗數千粒重均低于ZH11。其余3個性狀（株高、穗長和每穗實粒數）在純合突變株系與ZH11間均存在顯著或極顯著差異，其中純合突變株系CF54-6和CF54-10的株高分別為92.8和92.5 cm，較ZH11顯著增加10.7%和10.4%;穗長分別為22.4和22.0 cm，較ZH11極顯著增加22.4%和20.2%;每穗實粒數分別為105.8和103.4粒，較ZH11顯著增加10.3%和7.8%。可見，T-DNA插入明顯影響水稻植株的農藝性狀。

3 討論

水稻T-DNA插入突變體是研究基因功能的良好材料。當受體基因組中插入外源DNA片段后，可能會影響被插入的目標基因或上、下游基因的功能，也可能激活或沉默遠離插入位點的基因功能（趙潔等，2013）。已有研究表明，T-DNA易插入在基因富集、轉錄活躍的區(qū)域，41.9%的插入位點位于基因間，25.0%的插入位點位于基因上、下游500 bp內的功能區(qū)（Chen et al.，2010）。本研究供試材料水稻T-DNA插入突變體CF54的插入位點位于Os07g44710基因下游9.94 kb和Os07g44730基因上游2.02 kb的區(qū)域，未見插入任何有注釋功能的基因內部，其中，Os07g44710基因編碼鈣調素依賴性蛋白激酶。鈣調蛋白激酶是一種調節(jié)生物細胞功能作用的蛋白質，通過與鈣離子結合形成復合物后與靶酶結合，進而調控生物細胞的生長發(fā)育（胡德文等，1999）。本研究結果表明，未經生長激素處理時，純合突變株系CF54-6和CF54-10植株上蜜露分泌量和蟲體增重量與ZH11無顯著差異，說明T-DNA插入對水稻褐飛虱抗性影響不明顯，但這2個株系的穗長、每穗實粒數和株高與ZH11存在極顯著或顯著差異，其原因可能是T-DNA插入位點影響了鈣調蛋白激酶基因的表達。但與插入位點更近的注釋基因Os07g44730為未知蛋白基因，其可能參與信號通路介導的抗性反應及植物的生長發(fā)育調控。另外，由于插入位點所在的間隔區(qū)長達11.96 kb，也可能在該區(qū)段內有未知的功能基因或未知的調控序列存在。

前人研究表明，施用外源MeJA、SA和ET可誘導植株產生抗性，影響植食性昆蟲的取食和生長發(fā)育，昆蟲表現(xiàn)為體重下降或拒食（桂連友等，2004;龍亞芹等，2009;Lu et al.，2014）。本研究利用MeJA、SA和ET 3種外源生長激素處理ZH11及其純合突變株系CF54-6和CF54-10后，結果發(fā)現(xiàn)，三者植株上褐飛虱的蟲體增重量和蜜露分泌量均呈下降趨勢，其中，經MeJA處理的純合突變株系CF54-6和CF54-10植株上褐飛虱抗性較ZH11顯著下降，說明3種外源生長激素均能誘導水稻野生型及其純合突變株系植株對褐飛虱的取食與生長發(fā)育產生抑制作用，尤其是MeJA抑制效果更佳，推測這2個突變株系抗蟲性受JA信號途徑的影響。郭安（2009）研究也發(fā)現(xiàn)，水稻T-DNA右邊界側翼插入的一段281 bp DNA序列（NtTLA）后，MeJA處理可增強水稻T-DNA插入突變體中NtTIA的表達水平，推測NtTIA參與JA信號途徑中的抗病防衛(wèi)機制。可見，與SA和ET相比，MeJA對水稻T-DNA插入突變體CF54的褐飛虱抗性誘導作用更強，可能是T-DNA插入導致突變體植株后JA介導的信號通路被激活，外源MeJA處理產生更多防御抗蟲物質的原因。因此，下一步應深入分析T-DNA插入位點兩端的序列特征，檢測其轉錄表達情況及其與JA信號途徑基因的關系，探討插入位點與抗蟲性的關系。

4 結論

ET、SA和MeJA 3種外源生長激素均能誘導水稻野生型及其純合突變株系植株對褐飛虱的取食與生長發(fā)育產生抑制作用，尤其是MeJA抑制效果最佳，推測突變株系抗蟲性受茉莉酸（JA）信號途徑的影響。T-DNA插入明顯影響水稻植株的農藝性狀。

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（責任編輯 陳 燕）