合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑的HPLC指紋圖譜研究

田方 孫福仁 張肖建 李雪利 耿彥梅 高晗 李軍山

摘要：為全面反映合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑多種組分的面貌，明確合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑的HPLC指紋圖譜，對(duì)15批合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行了HPLC指紋圖譜測(cè)定及相似度評(píng)價(jià)。采用HPLC方法，色譜柱為WatersSymmetryshieldRPC18柱（4.6mm×250mm，5μm），以乙腈-0.04%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，流速為1mL/min，柱溫為25℃，對(duì)照指紋圖譜對(duì)合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)及聚類(lèi)分析。結(jié)果表明，15批合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜中呈現(xiàn)10個(gè)共有峰，相似度為0.967～0.998，表明合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑具有良好的一致性;此外，在10個(gè)共有峰中指認(rèn)出（-）-丁香樹(shù)脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、異槲皮苷2個(gè)化學(xué)成分。因此，合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜反映了合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑的多組分面貌，具有良好的可行性，可為合歡皮配方顆粒的多組分質(zhì)量控制提供參考。

關(guān)鍵詞：中藥化學(xué);合歡皮;標(biāo)準(zhǔn)湯劑;HPLC指紋圖譜;相似度;聚類(lèi)分析

中圖分類(lèi)號(hào)：R917文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1008-1534（2019）02-0128-07

合歡皮，別名合昏皮（《備急千金要方》）、夜合皮（《獨(dú)行方》）、合歡木皮（《本草綱目》）[1]，為豆科植物合歡AlbiziajulibrissinDurazz.的干燥樹(shù)皮，經(jīng)夏、秋兩季剝?nèi)『髸窀啥茫哂薪庥舭采瘛⒒钛[的功效，臨床上用于心神不安、憂郁失眠、肺癰、瘡腫、跌撲傷痛等癥的治療[2]。中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑是指在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，選取道地藥材或主產(chǎn)區(qū)藥材，將其加工炮制成合格飲片后，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備而成的中藥飲片水煎劑型[3-4]。中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究為配方顆粒的質(zhì)量研究奠定了基礎(chǔ)。

目前，關(guān)于合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量研究的報(bào)道很少，相關(guān)指紋圖譜的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。合歡皮相關(guān)藥材的報(bào)道多集中于對(duì)其化學(xué)物質(zhì)種類(lèi)[5-9]、藥理作用[10-12]的研究，對(duì)于其指紋圖譜雖有研究，但部分色譜峰并未達(dá)到基線分離，分離效果也有待提高[13-14]。2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》對(duì)于合歡皮詞條僅收錄了合歡皮藥材和飲片單一化學(xué)成分的含量測(cè)定方法。中藥材成分復(fù)雜，一種化學(xué)成分指標(biāo)往往并不能代表藥材的整體質(zhì)量情況。合歡皮含有三萜、黃酮、木脂素、生物堿、鞣質(zhì)及多糖等多種化學(xué)成分，成分較為復(fù)雜，且水溶性木脂素類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)較為相似，這些都為指紋圖譜方法的制定帶來(lái)了一定的困難。本研究通過(guò)建立合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑的HPLC指紋圖譜，全面反映合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑多種組分的面貌，以期為合歡皮配方顆粒的質(zhì)量控制提供參考。

1主要儀器與材料

日本島津公司高效液相色譜儀（LC-20AT型泵），真空冷凍干燥機(jī)（Tofflon）），CPA225D分析天平（Sartorius），AE240電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo有限公司提供），KH3200E型超聲波清洗器（江蘇昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司提供）。

對(duì)照品（-）-丁香樹(shù)脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷，批號(hào)為111911-201603，中國(guó)食品藥品檢定研究院提供;對(duì)照品異槲皮苷，批號(hào)為111809-201403，中國(guó)食品藥品檢定研究院提供;色譜純乙腈，批號(hào)為20180713，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司提供;分析純甲醇，批號(hào)為20180611，北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司提供;15批合歡皮飲片，經(jīng)原河北省藥品檢驗(yàn)研究院孫寶惠主任鑒定為豆科植物合歡AlbiziajulibrissinDurazz.的干燥樹(shù)皮，水分、浸出物、（-）-丁香樹(shù)脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷等指標(biāo)均符合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》要求。飲片來(lái)源及標(biāo)準(zhǔn)湯劑編號(hào)見(jiàn)表1。

2方法與結(jié)果

2.1指紋圖譜方法建立

2.1.1色譜條件

色譜柱為WatersSymmetryshieldRPC18（4.6mm×250mm，5μm）;流動(dòng)相為乙腈-0.04%（體積分?jǐn)?shù)，下同）磷酸溶液，按照表2所示比例進(jìn)行梯度洗脫。檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，柱溫為25℃，流速為1mL/min，進(jìn)樣量為10μL。

2.1.2對(duì)照品溶液的制備

取（-）-丁香樹(shù)脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷對(duì)照品，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1mL含25μg的溶液。另取異槲皮苷對(duì)照品，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1mL含異槲皮苷10μg的溶液。

2.1.3供試品溶液的制備

取凍干膏粉適量，研細(xì)，取0.2g，精密稱(chēng)定，置入具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲（功率250W，頻率40kHz）30min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4方法學(xué)考察

1）精密度試驗(yàn)

取合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑（編號(hào)S10），按照“2.1.3”項(xiàng)所述方法制備供試品溶液。精密吸取10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值<0.7%，相對(duì)峰面積的RSD值<1.7%，表明儀器精密度良好，詳見(jiàn)表3和表4。

2）重復(fù)性試驗(yàn)

取合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑（編號(hào)S10），按“2.1.3”項(xiàng)所述方法分別制備6份供試品溶液，平行測(cè)定，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值<0.7%，相對(duì)峰面積的RSD值<3.2%，表明方法的重復(fù)性良好，詳見(jiàn)表5和表6。

3）穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品（編號(hào)S10）溶液，分別在0，2，5，8，12，16，21h進(jìn)樣測(cè)定，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值<0.8%，相對(duì)峰面積RSD值<2.3%，表明供試品溶液在0～21h穩(wěn)定，詳見(jiàn)表7和表8。

2.2指紋圖譜的分析

2.2.115批合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備

取合歡皮飲片100g，第1次加10倍水，浸泡30min，煎煮30min，過(guò)濾;第2次加8倍水，煎煮20min，過(guò)濾。合并2次水煎液，經(jīng)真空低溫濃縮、冷凍干燥后得到膏粉，即得合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑。

2.2.2對(duì)照?qǐng)D譜的建立及色譜峰指認(rèn)

精密吸取對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析，得到對(duì)照品HPLC色譜圖。精密稱(chēng)定

15批合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品，按“2.1.3”項(xiàng)所述方法制備供試品溶液，按“2.1.1”色譜條件進(jìn)行分析，得到合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜，見(jiàn)圖1。

通過(guò)與（-）-丁香樹(shù)脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、異槲皮苷對(duì)照品圖譜比對(duì)，確認(rèn)合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜中7號(hào)峰為（-）-丁香樹(shù)脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷，9號(hào)峰為異槲皮苷。

2.2.3樣品測(cè)定

照“2.1”項(xiàng)所述方法制備對(duì)照品溶液及供試品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液與15批合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄色譜圖，見(jiàn)圖2。

從15批合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC指紋圖譜可以看出，合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出峰時(shí)段較長(zhǎng)，呈現(xiàn)的峰數(shù)目較多，表明合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑化學(xué)成分較為復(fù)雜。比較15批合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC指紋圖譜測(cè)定結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，不同合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品呈現(xiàn)的指紋圖譜無(wú)明顯差異，15批合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑中10個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值為0.00%～1.09%，表明不同產(chǎn)地的合歡皮飲片制成的標(biāo)準(zhǔn)湯劑具有類(lèi)似的化學(xué)成分，但S1—S10相對(duì)峰面積的RSD值為0.00%～60.78%，差異均較顯著，表明合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑化學(xué)成分含量存在顯著差異，初步分析可能和不同產(chǎn)地飲片間化學(xué)成分的含量差異和標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備過(guò)程中化學(xué)成分的轉(zhuǎn)移有關(guān)。

2.2.4相似度分析

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件”（2012版），分別對(duì)15批合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表9。

由表9可以看出，15批合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜整體相似度為0.967～0.998，表明15批合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑具有良好的一致性。

2.2.5聚類(lèi)分析

將15批合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑相對(duì)共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS19.0，進(jìn)行聚類(lèi)分析，分類(lèi)依據(jù)為平均歐氏距離。結(jié)果見(jiàn)圖3。

15批合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑被分為2大類(lèi)，其中，湖北1、湖北2、湖北十堰、四川都江堰4個(gè)產(chǎn)地被分為第1大類(lèi)，其余產(chǎn)地被分為第2大類(lèi)。在第2大類(lèi)中又分為4個(gè)小類(lèi)，河南廬陽(yáng)嵩縣、湖北宜昌被分為單獨(dú)2個(gè)小類(lèi)，湖北3、陜西商洛、湖南永州、河南盧氏被分為一小類(lèi)，其余產(chǎn)地為一類(lèi)。從分類(lèi)結(jié)果可知，湖北5個(gè)產(chǎn)地中，僅湖北1、湖北2、湖北十堰3個(gè)產(chǎn)地在分類(lèi)上距離集中，其他2個(gè)產(chǎn)地在分類(lèi)上距離較遠(yuǎn)。河南2個(gè)產(chǎn)地同樣在分類(lèi)上距離較遠(yuǎn)。15批合歡皮飲片在產(chǎn)地上具有代表性，指紋圖譜能夠反映出不同產(chǎn)地間的樣品差異。

3結(jié)論

1）近來(lái)來(lái)，受?chē)?guó)家政策的影響，中藥配方顆粒因其方便快捷等特點(diǎn)受到越來(lái)越多人的關(guān)注[15-16]。中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑作為中藥配方顆粒制備工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究基準(zhǔn)，在國(guó)家出臺(tái)的《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》（征求意見(jiàn)稿）中有明確的要求。而中藥指紋圖譜能最大限度獲取有用化學(xué)信息，有效控制中藥產(chǎn)品的質(zhì)量[17]。

2）在《中華人民共和國(guó)藥典》合歡皮含量測(cè)定的基礎(chǔ)上，嘗試了用甲醇-0.04%磷酸、乙腈-0.04%磷酸、乙腈-水、甲醇-水、乙腈-1%醋酸等不同流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，并對(duì)洗脫梯度進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)不同柱溫（25，30，35℃）、供試品的提取溶劑（50%甲醇、70%甲醇、甲醇、水）、超聲時(shí)間（10，30，60min）和波長(zhǎng)進(jìn)行了篩選，通過(guò)優(yōu)化最終得到了本研究的色譜條件。

3）采用高效液相色譜法，首次建立了合歡皮飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜，總出峰時(shí)段較長(zhǎng)，呈現(xiàn)的峰數(shù)目眾多，所得圖譜基線較為平直，分離度較好，解決了合歡皮化學(xué)成分復(fù)雜、分離效果不理想的難題，并從中指認(rèn)出（-）-丁香樹(shù)脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、異槲皮苷2個(gè)化學(xué)成分，方法具有良好的可行性，可為后續(xù)合歡皮配方顆粒多組分質(zhì)量控制提供參考。由于出峰數(shù)目眾多，其他峰的化學(xué)物質(zhì)指認(rèn)尚需進(jìn)一步研究。

4）測(cè)定了15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜，得出的相似度較高，說(shuō)明合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑具有良好的一致性。通過(guò)對(duì)15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜進(jìn)行聚類(lèi)分析，發(fā)現(xiàn)受不同產(chǎn)地的影響，合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜有所差異。這說(shuō)明固定中藥材產(chǎn)地對(duì)合歡皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量控制意義重大，也為后續(xù)研究提供了方向。

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