百合灰霉病病原菌鑒定及其部分生物學特性測定

杜艷麗 曹興 王桂清 等

摘要：【目的】鑒定北京昌平地區百合灰霉病病原菌，并明確其生物學特性，為該病害的預測、防治及百合抗病育種提供理論依據。【方法】利用柯赫氏法則從東方百合索邦灰霉病病株中分離純化獲得致病菌，結合形態學及分子生物學方法鑒定病原菌種類;并利用菌落生長法和血球計數板孢子計量法研究病原菌的生物學特性。【結果】從索邦灰霉病葉片病斑上分離獲得灰霉病病原菌（標記為CX1），利用形態學和分子生物學方法鑒定CX1菌株為灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers.）。CX1菌株菌絲生長和產孢的最適培養基為PSA培養基，最適溫度為20 ℃，最適光照環境為光暗交替（12 h光照/12 h黑暗），菌絲生長的最適pH為5～6，產孢的最適pH為6，菌絲生長和產孢的最適碳源分別為可溶性淀粉和蔗糖，最適氮源分別為牛肉膏和硫酸銨。【結論】引起北京昌平地區百合灰霉病的病原菌為灰葡萄孢菌。依據百合灰葡萄孢菌的生物學特性，生產中除使用化學和生物防治外，還可通過改變栽培環境、合理施肥、合理灌溉、合理密植、輪作等農業措施來抑制灰葡萄孢菌的生長和產孢，從而減輕病害發生。

關鍵詞： 百合;灰霉病;病原菌鑒定;灰葡萄孢;生物學特性

中圖分類號：S436.81? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）02-0307-08

Abstract：【Objective】The present study was performed to identify the pathogen causing lily gray mold in Changping District， Beijing City， and to determine biological characteristics of the pathogen. The results would provide a scientific basis for forecasting， control and resistance breeding of lily gray mold. 【Method】The gray mold pathogen was isolated and purified from Lilium Oriental hybrid Sorbonne strains according to Koch’s rule and identified combining morphological characteristics study and molecular biological analysis. Biological characteristics of the pathogen were determined by measuring the diameter of the colony and counting the number of conidia using hemocytometer measurement. 【Result】The gray mold pathogen isolated from the pathogenetic lily leaves was marked as CX1. CX1 was identified as Botrytis cinerea Pers. according to morphological characteristics study and molecular biological analysis. For the mycelial growth and sporulation of CX1， the optimum medium was PSA， the optimum temperature was 20 ℃ and the optimum light condition was 12 h∶12 h alternation of light and darkness. The optimal pH value for mycelial growth and sporulation were 5-6 and 6， respectively. Soluble starch was the best carbon source and beef extract was the best nitrogen source for mycelial growth. The optimum carbon source and nitrogen source for sporulation were sucrose and （NH4）2SO4， respectively.? 【Conclusion】The pathogen of lily gray mold occurs in Changping， Beijing was B. cinerea Pers. Based on the studies about biological characteristics of B. cinerea Pers.， apart from chemical and biological controls， growth of B. cinerea Pers. and sporulation can be inhibited by changing cultivation environment， reasonable fertilization， irrigation， planting density and rotation， so as to reduce the disease damage.

Key words： lily; gray mold; pathogen identification; Botrytis cinerea Pers.; biological characteristics

0 引言

【研究意義】百合（Lilium spp.）是百合科百合屬球根植物，主要分布在亞洲東部、歐洲、北美洲等北半球溫帶地區。除傳統藥用、食用和提取香精外，百合花大色艷、花色多變、氣味芳香，在我國被廣泛栽培用作切花、盆花、園林綠化和專類園等（包滿珠，2011）。但百合是一種較易感病的花卉，可發生真菌性病害、細菌性病害、病毒性病害、生理性病害和線蟲病害等，其中發生面積較大、危害較嚴重的病害主要有灰霉病、枯萎病和病毒病，已成為遏制百合產業發展的重要因素之一。百合灰霉病又稱葉枯病，主要危害百合的葉、莖和花，導致葉片枯死、花器褐腐、莖稈發黑和鱗莖停止生長，嚴重影響切花及種球的產量和質量（朱麗梅等，2011）。因此，鑒定百合灰霉病病原菌，研究其生物學特性，對百合灰霉病預測、防治及抗病品種選育等均具有重要意義。【前人研究進展】引起江西、江蘇南京、甘肅蘭州和廣西永福地區百合灰霉病的致病菌為橢圓葡萄孢[Botrytis elliptica（Berk.） Cooke.]（唐祥寧等，1998;朱麗梅等，2010;白濱等，2013;仇碩等，2018）。橢圓葡萄孢孢子萌發的最適溫度為l5～20 ℃，相對濕度90%～100%時發病潛育期為20～24 h，2 d后進入盛發期（唐祥寧等，1998）。不同品種對百合灰霉病的抗性存在差異，法蘭西和羅蒂娜為高感品種，康斯坦薩和索邦為高抗品種（朱麗梅等，2010）。深綠木霉蛋白質TraT2A能夠誘導蘭州百合對灰葡萄孢的抗性（梁巧蘭等，2017）。Cao等（2018）首次鑒定灰葡萄孢（B. cinerea）為百合（鐵炮百合）葉枯病病原菌。目前，針對百合灰葡萄孢菌生物學特性的研究尚未見報道。【本研究切入點】近年來，北京市昌平區溫室栽培的東方百合索邦和西伯利亞等品種灰霉病發生嚴重，影響了切花的產量和質量，造成較大的經濟損失，但尚無針對該地區主栽東方百合灰霉病病原菌鑒定及生物學特性等的相關研究報道。【擬解決的關鍵問題】采集北京市昌平區東方百合雜種系索邦的灰霉病病株，采用常規組織分離法分離病原菌，結合形態學和分子生物學鑒定病原菌種類，并對病原菌在不同培養條件下的菌落直徑和產孢量等生物學特性進行研究，以期為該病害的預測、防治和百合抗病育種打下理論基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料為具有典型灰霉病癥狀的東方百合雜種系（Lilium Oriental hybrids）索邦（Sorbonne）病株，采集自北京市昌平區李村百合生產合作社。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 病原菌鑒定

1. 2. 1. 1 病原菌分離與純化 無菌水沖洗具有典型灰霉病癥狀的百合葉片，于超凈工作臺內切取病健交界處組織，剪成5 mm×3 mm小塊，用75%酒精浸泡1 min，0.1%氯化汞浸泡30 s，無菌水沖洗3次。采用組織分離法，于PDA培養基上20 ℃培養，采用單孢分離法純化（方中達，2007）。

1. 2. 1. 2 致病性測定 孢子接種測定：用無菌水配制菌株孢子懸液，將菌懸液噴灑于健康的盆栽索邦葉片背、腹面，以噴灑無菌水為對照。于人工氣候室22 ℃保濕培養，逐日觀察癥狀，及時記錄發病情況并拍照。

菌餅接種測定：菌株在PDA培養基上培養7 d后，用打孔器取直徑7 mm的菌餅，用消毒的訂書釘將菌餅固定于健康的盆栽索邦葉片中央，以貼PDA片為對照。每處理3株，3次重復。于人工氣候室22 ℃保濕培養，及時觀察發病狀況并拍照。

根據柯赫氏法則，從接種發病的百合葉片再次分離純化致病菌。

1. 2. 1. 3 形態與分子鑒定 形態鑒定：將分離純化的菌株在PDA培養基上20 ℃培養3 d，待菌絲快長滿培養基時觀察菌落特征。同時用水作為浮載劑，用OLYMPUS BX51顯微鏡觀察菌絲和孢子形態并拍照。

分子生物學鑒定：使用D3390-02 Fungal DNA Kit試劑盒（Omega Bio-Tek公司）提取菌株基因組DNA。利用PCR擴增rDNA-ITS序列及HSP60、G3PDH和RPB2等基因（Cao et al.，2018）。所得基因序列在NCBI網站用BLAST進行比對分析，利用MEGA 5.0構建系統發育進化樹。

1. 2. 2 病原菌的生物學特性研究 將直徑為7 mm的病原菌菌餅分別接種于供試培養基（d=90 mm）中央，置于培養箱中培養，研究培養基種類、溫度、光照、pH、碳源和氮源對病原菌菌絲生長和產孢量的影響。

1. 2. 2. 1 不同培養基對菌絲生長和產孢量的影響 供試培養基分別為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）、改良沙氏葡萄糖蛋白胨瓊脂培養基（mSDA）、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基（PSA）、馬鈴薯麥芽糖瓊脂培養基（PMA）、察氏培養基（CDA）和基礎培養基（BM）等6種固體培養基。

1. 2. 2. 2 不同溫度、光照、pH對病原菌菌絲生長和產孢量的影響 培養溫度設5、10、15、20、25、30和35 ℃ 7個處理;光照條件設全光照、光暗交替（12 h光照/12 h黑暗）和全黑暗3個處理;pH設3、4、5、6、7、8、9、10、11和12等10個處理。

1. 2. 2. 3 不同碳源、氮源對病原菌菌絲生長和產孢量的影響 以CDA培養基為基礎培養基，將蔗糖分別用等量的葡萄糖、麥芽糖、果糖、乳糖、海藻糖、可溶性淀粉和微晶纖維素代替，制成不同碳源培養基，以無碳源培養基為對照;以CDA培養基為基礎培養基，將硝酸鈉分別用等量的硫酸銨、氯化銨、牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、尿素、甘氨酸和天門冬酰胺代替，制成不同氮源的培養基，以無氮源培養基為對照。

試驗中若無特殊說明，培養條件均為PDA培養基、20 ℃、全黑暗。每處理3次重復。培養76 h后采用十字交叉法測量菌落直徑，88 h后采用血球計數板法測量孢子量。

1. 3 統計分析

利用Excel 2007和SPSS 18.0處理分析試驗數據。

2 結果與分析

2. 1 百合灰霉病病原菌的分離鑒定結果

2. 1. 1 病原菌的分離與形態鑒定 從索邦灰霉病葉片病斑上分離純化獲得的菌株（標記為CX1）培養性狀和形態特征表現為：在PDA培養基上20 ℃培養，菌落圓形、疏松，生長較快，培養3～4 d即可長滿培養基;氣生菌絲絨毛狀，初期白色，后轉灰色（圖1-A和圖1-B）;培養后期可見黑色菌核;菌絲具隔，不規則分支，分支處有隘縮（圖1-C）;分生孢子梗細長，無色，有隔膜，頂端細胞膨大成球形，上面有許多小梗;分生孢子單胞，無色，橢圓形，著生小梗上聚集成葡萄穗狀（圖1-D和圖1-E）。根據培養性狀和菌絲、孢子形態，初步鑒定CX1菌株為灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers.）。

2. 1. 2 致病性測定 將CX1菌株接種到索邦植株上進行致病性測定。孢子接種7 d，植株上部葉片出現紅褐色小點，逐漸擴大呈圓形或橢圓形，中央灰白色，邊緣紅褐色，病斑變薄而脆，半透明狀。葉緣與葉尖發病時，葉枯現象更嚴重（圖2-A）。菌餅接種3 d，葉片出現紅褐色病斑，初為圓形，后擴大呈橢圓形或不規則形，病斑變薄而脆，半透明狀，由于針孔導致崩裂（圖2-B）。室內活體接菌引起的病癥與田間癥狀基本一致。從發病組織上再次分離純化致病菌，在PDA培養基上的培養性狀及菌絲、孢子特征均與原接種菌株一致。根據柯赫氏法則，表明原接種菌株為病原菌。

2. 1. 3 病原菌分子生物學鑒定 用ITS1和ITS4作引物對，對CX1菌株進行rDNA-ITS序列擴增。測得該序列長度為539 bp，與灰葡萄孢菌或富克葡萄孢盤菌（Botryotinia fuckeliana）的同源性為100%（圖3-A）。對HSP60、G3PDH和RPB2等基因的測序結果表明，CX1菌株與灰葡萄孢菌的同源性均為100%（圖3-B）。結合形態特征，可鑒定東方百合索邦灰霉病病原菌為灰葡萄孢菌（B. cinerea Pers.）。

2. 2 百合灰霉病病原菌灰葡萄孢菌生物學特性

2. 2. 1 不同培養基對CX1菌株菌絲生長和產孢量的影響 表1結果表明，不同培養基對CX1菌株菌絲生長和產孢量的影響顯著（P<0.05，下同）。CX1菌株在PSA培養基上生長最快，培養至第76 h，菌落直徑為7.30 cm;在BM培養基上的菌落直徑最小，為4.12 cm，且菌絲極稀疏。培養至第88 h，CX1菌株在PSA培養基的產孢量最多，為2.83×106個/皿，其次為PMA和PDA培養基，在CDA和mSDA培養基上的產孢量較少，在BM培養基上的產孢量最少。因此，CX1菌株菌絲生長和產孢的最適培養基為PSA培養基。

2. 2. 2 不同溫度、光照和pH對CX1菌株菌絲生長和產孢量的影響 表2結果表明，溫度過低（5 ℃）或過高（30～35 ℃）均可顯著抑制CX1菌株的菌絲生長和產孢。15～25 ℃為CX1菌株菌絲生長的適宜溫度，最適溫度為20 ℃;產孢的適宜溫度為20～25 ℃，最適溫度為20 ℃。CX1菌株菌絲在光暗交替（12 h光照/12 h黑暗）條件下生長最快，與全光照處理相比，菌落直徑差異不顯著（P>0.05），但顯著高于全黑暗處理。光暗交替條件下產孢量最多，顯著高于全光照或全黑暗環境。CX1菌株在pH 3～10范圍內均可生長，在pH 4～8時生長較快，最適pH為5～6;隨著pH的增大，產孢量呈先增加后減少的趨勢，當pH為5～7時產孢量較高，pH為6時產孢量最高。

2. 2. 3 不同碳源和氮源對CX1菌株菌絲生長和產孢量的影響 由表3可看出，CX1菌株在無碳或無氮培養基上均能生長，但菌絲極稀疏。與對照相比，添加不同碳源促進了菌絲的生長;最適宜菌絲生長的碳源為可溶性淀粉，其次為果糖和葡萄糖等，微晶纖維素效果最差;以蔗糖為碳源的培養基產孢量最多，其次為葡萄糖、麥芽糖和可溶性淀粉，海藻糖和微晶纖維素的效果較差。與對照相比，在培養基中添加尿素、甘氨酸、氯化銨或天門冬酰胺等抑制了菌絲的生長;菌絲在以牛肉膏為氮源的培養基中生長最快，其次為酵母浸膏和蛋白胨，表明灰葡萄孢菌對上述有機氮的利用效果較好;以氯化銨或硫酸銨等銨態氮為氮源時菌絲生長較慢，但產孢量最多。

3 討論

依據致病性和形態特征，鑒定江西、江蘇南京、甘肅蘭州及廣西永福地區百合灰霉病及百合葉枯病的致病菌為橢圓葡萄孢（唐祥寧等，1998;朱麗梅等，2010;白濱等，2013;仇碩等，2018）。橢圓葡萄孢菌絲生長的適宜溫度為20～25 ℃，孢子萌發的適宜溫度為l5～20 ℃，萌發時需要較高的相對濕度（唐祥寧等，1998;白濱等，2013）。橢圓葡萄孢以菌絲體和菌核在病株和土壤中越冬，翌年春天，菌絲體和菌核產生分生孢子，通過風、雨傳播到植株上形成初侵染，條件適宜可發生多次再侵染。在冷涼、多濕的環境下，病菌可產生大量分生孢子，引起病害流行（瞿友均和徐源輝，2010）。近年來，北京市昌平區的溫室觀賞百合生產基地由于多年連作，百合灰霉病逐年加重，冬季陰雨天病害尤為嚴重，本研究運用形態學結合分子生物學方法鑒定該地區主栽的東方百合索邦灰霉病病原菌為灰葡萄孢，該菌也能引起鐵炮百合發生葉枯病（Cao et al.，2018）。為便于病害的流行預測和防治，本課題組進一步研究了灰葡萄孢菌的生物學特性，結果顯示，灰葡萄孢菌CX1菌株生長和產孢的最適培養基為PSA培養基，與袁月等（2016）對人參灰葡萄孢PJAR1和PJAL3等菌株的研究結果相近，而海棠灰霉病菌在PDA培養基上生長及產孢速度較快（劉春元等，2003）。鞏慧玲等（2015）對Aspergillus flavus和Rhizopus oryzae的研究表明，兩種病原菌在百合培養基和百合葡萄糖培養基上菌絲生長和產孢量顯著高于PSA、PDA和PMA等培養基，該結果對今后的研究有借鑒意義。CX1菌株菌絲生長和產孢的最適溫度為20 ℃，與越橘灰霉病病原菌灰葡萄孢菌的生物學特性一致（陳長卿等，2012），高于30 ℃時，菌絲生長和產孢受到嚴重抑制，與灰霉病在低到中溫迅速傳播蔓延的發病規律相吻合（羅長維和陳友，2018）。全黑暗條件有利于玫瑰灰葡萄孢菌的生長（張悅等，2015），但本研究發現百合灰葡萄孢菌在全黑暗條件下的生長速率顯著低于光暗交替和全光照環境。百合灰葡萄孢菌在偏酸環境中（pH 5～6）生長較快，與報道的玫瑰（張悅等，2015）、越橘（陳長卿等，2012）、香蔥（李聰麗等，2017）等其他植物的灰霉病菌生物學特性基本相同。分離自葡萄的灰葡萄孢菌在以蛋白胨為氮源時，其菌絲生長和產孢量均顯著高于甘氨酸、硫酸銨和尿素等氮源（高智謀等，2009），最利于香蔥灰葡萄孢菌生長的碳源是可溶性淀粉（李聰麗等，2017），蔗糖和葡萄糖均能較好地促進灰葡萄孢菌產孢（王丹，2008），本研究也得到相似的結果。氯化銨和硫酸銨等銨態氮最不利于煙草灰葡萄孢分生孢子的形成，本研究得到相反的結論，即以氯化銨或硫酸銨為氮源有利于百合灰葡萄孢菌產孢。以上的研究結果表明，灰葡萄孢菌的生物學特性隨寄主的不同而異。本研究僅探討了灰葡萄孢菌菌落直徑和產孢量兩個指標，具有一定的局限性，今后應進一步研究各因素對孢子萌發、致死溫度、菌核形成等的影響，以期為百合灰霉病的預測和防治提供更多理論依據。除病原菌的鑒定及生物學特性研究外，對百合灰霉病的研究還涉及病害發生規律及綜合防治（瞿友均和徐源輝等，2010）、化學與生物防治（Chiou and Wu，2003;劉樹芳等，2006;朱麗梅等，2011;梁巧蘭等，2017）、抗病種質資源（朱麗梅等，2010;杜運鵬，2014）及抗病機制（韓青等，2015;宋翔宇，2016）等，本課題組下一步的研究工作聚焦在百合灰霉病的生物防治與抗病關鍵基因的發掘方面。

4 結論

引起北京昌平地區百合灰霉病的病原菌為灰葡萄孢菌（B. cinerea Pers.）。百合灰葡萄孢菌菌絲生長和產孢的最適培養基為PSA培養基，最適溫度為20 ℃，最適光照環境為光暗交替（12 h光照/12 h黑暗），菌絲生長的最適pH為5～6，產孢的最適pH為6，菌絲生長和產孢的最適碳源分別為可溶性淀粉和蔗糖，最適氮源分別為牛肉膏和硫酸銨。依據百合灰葡萄孢菌的生物學特性，生產中除使用化學和生物防治外，還可通過改變栽培環境、合理施肥、合理灌溉、合理密植、輪作等農業措施來抑制灰葡萄孢菌的生長和產孢，從而減輕病害發生。

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（責任編輯 麻小燕）