降糖消渴顆粒含藥血清對INS-1細胞磷酸肌醇-3激酶/AKT/FOXO1通路的影響

莫芳芳 劉海霞 華靜 趙丹丹 高思華

摘要? 目的：通過研究降糖消渴顆粒含藥血清對INS-1細胞PI3K/AKT/FOXO1通路中相關蛋白與基因表達的影響，探討降糖消渴顆粒含藥血清保護胰島B細胞的分子機制。方法：選取FOXO1高表達INS-1穩定細胞株，分別以1%、5%、10%、15%、20%不同濃度降糖消渴顆粒含藥血清干預，用MTT法計算細胞成活率以觀察藥物毒性，分別檢測各組細胞中總FOXO1蛋白水平以確定最佳藥物濃度開展后續實驗。細胞用或不用PI3K抑制劑LY294002干預后，以Western blotting檢測細胞中總FOXO1、p-FOXO1、Akt、p-Akt和細胞核內外的FOXO1、p-FOXO1的蛋白表達，qRT-PCR檢測FOXO1mRNA和AktmRNA含量。結果：不同濃度含藥血清對細胞均無毒性，其中10%為最佳藥物干預濃度。10%含藥血清使磷酸化FOXO1和Akt的表達升高;在胞質和胞核中，10%含藥血清使FOXO1的表達降低，磷酸化表達升高，抑制劑LY294002使FOXO1和p-FOXO1表達均降低。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）結果顯示，Akt mRNA表達升高，FOXO1mRNA表達降低，抑制劑使FOXO1mRNA表達降低，結果與Western blotting結果一致。結論：降糖消渴顆粒含藥血清可通過PI3K/AKT/FOXO1通路促進FOXO1磷酸化出核以抑制FOXO核轉錄實現保護胰島B細胞的作用。

關鍵詞? 肝脾腎同調;降糖消渴顆粒;PI3K/AKT/FOXO1通路;FOXO1因子;胰腺;INS-1細胞;2型糖尿病;含藥血清

Effects of Jiangtang Xiaoke Granules Containing Serum on Phosphoinositide-3 Kinase/AKT/FOXO1 Signaling Pathway in INS-1 Cells

Mo Fangfang1， Liu Haixia1， Hua Jing2， Zhao Dandan1， Gao Sihua1

（1 Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China; 2 Third Affiliated Hospital of Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

Abstract Objective： To study the effects of Jiangtang Xiaoke Granules containing serum on expressions of protein and genes of phosphoinositide-3 kinase （PI3K）/AKT/FOXO1 signaling pathway in INS-1 cells to explore the molecular mechanism of serum contained Jiangtang Xiaoke Granules on protecting β-cells.? Methods： The FOXO1 high expression INS-1 stable cell line was selected and treated with 1%， 5%， 10%， 15% and 20% different concentrations of Jiangtang Xiaoke Granules containing serum. The cell survival rate was calculated by MTT method to observe the toxicity of the drug. The total FOXO1 protein level in each group was detected to determine the optimal drug concentration for subsequent experiments. The cells were transfected with or without the PI3K inhibitor LY294002. Western blotting was used to detect the expression of FOXO1， p-FOXO1， Akt， p-Akt and FOXO1 and p-FOXO1 in the nucleus. The expression of FOXO1 mRNA and Akt mRNA was detected by qRT-PCR.? Results： Different concentrations of drug-containing serum were not toxic to cells， and 10% of them were the optimal drug intervention concentration. The expression of phosphorylated FOXO1 and Akt was increased with 10% drug-containing serum. In the cytoplasm and nucleus， the expression of FOXO1 was decreased and the expression of phosphorylation was increased with 10% drug-containing serum， and the expression of FOXO1 and p-FOXO1 were decreased by the inhibitor LY294002. The results of real-time quantitative PCR （qRT-PCR） showed that the expression of Akt mRNA was increased， the expression of FOXO1 mRNA was decreased， and the expression of FOXO1 mRNA was decreased by inhibitor. The results were consistent with the results of Western blotting.? Conclusion： The drug-containing serum of Jiangtang Xiaoke Granules can promote the phosphorylation of FOXO1 through the PI3K/AKT/FOXO1 pathway to inhibit the transcription of FOXO nuclear to protect islet B cells.

Key Words? Common regulation of liver， spleen and kidney; Jiangtang Xiaoke Granules， PI3K/AKT/FOXO1 signaling pathway; FOXO1; pancreas; INS-1 cells; Type 2 diabetes mellitus; Serum containing drug

中圖分類號：R242;R587.1 文獻標識碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2019.02.020

2型糖尿病（Diabetes Mellitus，Type 2， T2DM）是一種以胰島素分泌不足和胰島素抵抗為基本特征的慢性糖脂代謝紊亂性疾病[1-2]。眾所周知，胰島素抵抗是T2DM的最主要病理機制，然而胰島細胞功能受損導致胰島素分泌不足在T2DM病理中的作用也越來越受到重視。近年有研究表明胰島B細胞功能受損可導致胰島素分泌不足還會降低各組織對胰島素的敏感性，進一步影響胰島素抵抗[3-4]。因此，恢復胰島B細胞功能應是T2DM治療的重要方面。

導師高思華教授在多年臨證經驗中總結出肝脾腎同調治療T2DM，而降糖消渴顆粒正是在此理論指導下所形成的方劑，目前已經取得了比較滿意的臨床療效[5]。此外，在前期實驗中已經證實，降糖消渴顆粒含藥血清能夠很好的改善INS-1細胞胰島素分泌功能，促進細胞中FOXO1磷酸化水平[6]。本研究繼續以降糖消渴顆粒含藥血清干預INS-1細胞，探討降糖消渴顆粒對PI3K/AKT/FOXO1通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和細胞

選取SD大鼠20只，雄性，8周齡，體質量180～220 g，平均體質量（200±20）g，購自北京維通利華實驗動物中心（合格證號：SCXK（京）2012-0001）。INS-1大鼠胰島瘤細胞株購自北京協和醫學院細胞資源中心。

1.1.2 藥物

由北京中醫藥大學中藥科技發展部生產降糖消渴顆粒的成藥顆粒劑型，經質量鑒定，顆粒含5.01 g/kg生藥，在北京中醫藥大學糖尿病研究中心實驗室內保存藥物樣品（4 ℃保存），以備參考。實驗臨用時，將顆粒混入蒸餾水中配制成所需濃度的混懸液[7]。

1.1.3 試劑與儀器

電泳和轉膜裝置、XRS凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）;熒光定量PCR儀（美國Thermo公司）。FG，POWER SYBR GREEN PCR（INVITROGEN）;胎牛血清（EVERY GREEN）;β-巰基乙醇（Genview）;四環素Doxycycline（Genechem）;LY294002抑制劑（Selleck）;RNeasy Mini Kit（QIAGEN）;青/鏈霉素（HYCLONE）;胰蛋白酶（SOLARBIO）;RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（FERMENTAS）;AKT抗體、FOXO1抗體和磷酸化Akt（Thr308）抗體（CST）;磷酸化FOXO1 A（Ser-256）（Abcam）;RPMI-1640培養基、PCR引物購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

設正常組、模型組、降糖消渴顆粒含藥血清組（1%、5%、10%、15%、20%）和LY294002組。按體質量隨機分組：對照組10只，降糖消渴顆粒組10只，降糖消渴顆粒大鼠給藥劑量是臨床人公斤體質量用量的60倍，約每天52.8 g生藥/（kg·體質量）。每天早晚灌胃各1次，共7 d。對照組灌胃等量蒸餾水。末次灌胃后1 h，處死大鼠，經腹主動脈取血，4 ℃靜置1 h，3 000 r/min離心20 min，分離含藥血清，56 ℃水浴30 min滅活，微孔濾膜過濾除菌，凍存管分裝，-80 ℃保存備用[8]。

大鼠胰島瘤細胞株INS-1培養及模型制備：RPMI-1640培養基加入10%胎牛血清（FBS），100 IU/mL青鏈霉素，50 μmol/Lβ-巰基乙醇在37 ℃，5%CO2條件下無菌培養INS-1細胞，每24 h更換培養基1次，待細胞密度達到70% ～80%后細胞傳代凍存。細胞傳代2次后，細胞密度再次達到80%時應用慢病毒轉染的方法將含有FOXO1基因片段的質粒載體轉入INS-1細胞，經puromycin篩選獲得穩定表達FOXO1細胞株（OE）和陰性對照細胞株（NC），2.5 μg/mL Doxycycline干預12 h誘導FOXO1表達。用實時熒光定量PCR技術檢測NC、OE 2種細胞株中FOXO1基因的表達情況。OE組FOXO1基因的表達豐度是NC組的2倍以上說明FOXO1基因轉染成功，得到FOXO1高表達INS-1細胞模型[6]。

分別用20%、15%、10%、5%、1%含藥血清干預正常INS-1細胞與FOXO1高表達模型細胞，同時設立正常INS-1細胞對照組與FOXO1高表達模型細胞對照組。

用和不用Dox誘導OE細胞株得到FOXO1高表達模型細胞和正常對照細胞，再用不同濃度的含藥血清（20%、15%、10%、5%和1%）處理模型細胞24 h，提取總蛋白，檢測FOXO1蛋白的表達。

用或不用Dox誘導FOXO1高表達模型細胞，以10%FBS做對照，加或不加25 μmol/L PI3K抑制劑LY294002和10%含藥血清干預24 h。

1.2.2 給藥方法

將正常INS-1細胞和FOXO1高表達模型細胞分別以104密度種于24孔板培養12 h，再分別以不同濃度含藥血清干預24 h，經指標檢測篩選最佳給藥濃度后，含藥血清組加或不加25 μmol/L PI3K通路抑制劑LY294002培養24 h。

1.2.4 指標檢測與方法

1）MTT檢測：將INS-1細胞和FOXO1高表達模型細胞種于96孔板，每孔4 000個，12 h后，分別用20%、15%、10%、5%、1%含藥血清培養24 h，棄去液體，每孔加入90 μL的培養基和10 μL 5 mg/mL的MTT繼續培養4 h，棄去液體，加100 μL的DMSO溶解結晶，在570 nm測定吸光度。

2）Western blotting檢測：應用蛋白裂解液與核質蛋白分離提取試劑盒（Beyotime）分別提取細胞總蛋白、細胞質蛋白和核蛋白。BCA試劑盒測定蛋白濃度。以裂解液調整蛋白濃度至相同水平，按1∶ 1加入2X上樣緩沖液稀釋，沸水煮5 min。制備凝膠上樣，每個樣品加入30 μL，總蛋白量30 μg，電泳、轉膜。將聚偏二氟乙烯膜（PVDF取出，使用適量TBST溶液清洗。加入封閉液，室溫下，置于搖床上緩慢搖動2 h。移除封閉液，加入以封閉液稀釋的Ⅰ抗（Akt、phospho-Akt（Thr308）、FOXO1、phospho-FOXO1（Ser256）和β-actin稀釋比例1∶ 1 000）。在4 ℃條件下，置于搖床上，以適當速率孵育過夜。結束后室溫條件下TBST溶液洗滌3次，10 min/次，再以TBST溶液按1∶ 5 000稀釋Ⅱ抗，室溫下孵育1 h，結束后以TBST溶液清洗PVDF3次。按ECL試剎盒說明書配置ECL顯色液，凝膠成像儀曝光成像，分析條帶灰度并定量分析。

3）qRT-PCR檢測：收集細胞，加入TRIzol提取總RNA。應用Nano Drop2000超微量紫外分光光度計，選擇核酸（RNA）模式。校對后，依次檢測各樣品1 μL。通過A230、A260和A280值，對RNA純度、濃度進行檢測。將0.1 μg總RNA加入離心管，70 ℃條件下溫育10 min，短暫離心后置于冰上保存。按照反轉錄試劑盒說明書建立10 μL反應體系，反轉錄條件如下：42 ℃，15 min;95 ℃，5 min，4 ℃，5 min，-20 ℃保存。取上述反應液2 μL，2×SYBR Green mixture 5 μL;Forward primer 10 μmol/L，1 μL;Reverse primer 10 μmol/L，1 μL;Template DNA 1 μL;Rnase Free water 2 μL;反應總體積為10 μL。反應條件如下：95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s;60 ℃ 30 s;40 cycles。引物序列見表1。釆用溶解曲線分析方法，以Ct值為標準，根據公式計算各基因起始模版濃度。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，計量資料以平均數±標準誤差表示，多組比較用單因素方差分析，進而用最小顯著差異法進行兩兩比較，以 P <0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 含藥血清細胞毒性觀察

24 h1%、5%、10%、15%、20%含藥血清對INS-1正常細胞和FOXO1高表達INS-1模型細胞均無影響，提示含藥血清對細胞無毒性。見表2。

2.2 不同濃度含藥血清對FOXO1表達的影響

與空白對照組比較，其他組FOXO1蛋白相對表達明顯增加，差異有統計學意義（ P <0.05）。與模型空白對照組比較，含藥血清各組FOXO1蛋白相對表達有增加或減少趨勢，但差異無統計學意義（ P >0.05），其中10%含藥血清干預模型細胞所得FOXO1相對表達量減少趨勢最明顯，故選10%含藥血清做后續通路實驗。見圖1。

2.3 含藥血清對PI3K/AKT/FOXO1通路中相關蛋白及其磷酸化表達的影響

圖2A是細胞中總FOXO1、p-FOXO1、Akt和p-Akt的蛋白表達條帶，圖2B是細胞核中FOXO1、p-FOXO1蛋白表達條帶，圖2C是細胞質中FOXO1、p-FOXO1蛋白表達條帶。總蛋白中，FOXO1經Dox干預表達升高，含藥血清對其表達影響較小，加入抑制劑使FOXO1表達降低，p-FOXO1經Dox干預表達降低，含藥血清使其表達升高，抑制劑也會抑制p-FOXO1表達。Akt的表達沒有發生變化，而p-Akt經Dox干預表達降低，含藥血清促使其表達升高，抑制劑抑制p-Akt的表達。在胞核和胞質中，Dox干預使FOXO1表達升高，p-FOXO1表達降低，抑制劑使FOXO1和p-FOXO1表達均降低，含藥血清使FOXO1表達降低，p-FOXO1表達升高。

2.4 含藥血清對PI3K/AKT/FOXO1通路中相關基因表達的影響

Akt基因的相對表達在模型組和LY294002抑制劑組中減少，10%含藥血清促進Akt的表達;FOXO1基因的相對表達被LY294002抑制劑和10%含藥血清抑制，與模型組比較，差異有統計學意義（ P <0.05）。見圖3。

3 討論

FoxO是Fox（Forkhead）的一個亞族，對于細胞分化、凋亡，動物的生長發育、代謝以及炎性反應和免疫等方面有調控作用[9]。FOXO1（Forkhead box O1）又屬于FOXO亞家族中的一員。已有研究表明，胰島B細胞FOXO1的表達很豐富[10]。在高血糖發生和胰島B細胞線粒體代謝障礙過程中FOXO1信號傳導是中心環節之一[11-12]，經由PI3K/AKT/FOXO1途徑而影響B細胞應激、增殖、凋亡調控網絡[13-14]。

在胰島素/胰島素樣生長因子-1（INS/IGF-1）信號通路中，FOXO1是關鍵的轉錄因子之一，受磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/PKB）磷酸化級聯通路的調節。當PI3K/AKT途徑被激活后，FOXO1中3個保守的AKT/PKB蛋白激酶位點被磷酸化，迫使FOXO1發生核輸出，進而失去轉錄活性。相反，當胰島素信號減弱時，通過PI3K/AKT通路，AKT/PKB蛋白激酶活性降低，使FOXO1磷酸化水平降低，滯留在細胞核內，通過誘導靶基因表達而導致細胞功能的改變[15]。可見，FOXO1的活性受胰島素的負調節。

我們在前期實驗中發現，經降糖消渴顆粒含藥血清干預后，FOXO1高表達INS-1細胞中，葡萄糖消耗量和胰島素分泌量均有所增加。但經蛋白質免疫印跡和實時熒光定量PCR技術檢測，結果顯示FOXO1總蛋白量和mRNA水平均無顯著變化，而FOXO1蛋白的磷酸化水平卻升高明顯。這說明降糖消渴顆粒含藥血清促進了FOXO1高表達INS-1細胞中FOXO1的磷酸化，造成FOXO1核輸出，降低了其轉錄活性。而這很可能是通過激活了PI3K/AKT途徑，達到保護胰島B細胞的作用[12]。基于此，我們為進一步證實降糖消渴顆粒是否通過激活PI3K/AKT/FOXO1信號通路而發揮作用，本實驗對細胞用或不用PI3K抑制劑LY294002干預后細胞中總FOXO1、p-FOXO1、Akt、p-Akt和細胞核內外的FOXO1、p-FOXO1的蛋白表達以及FOXO1、Akt的mRNA含量進行檢測。結果表明在總蛋白中，含藥血清對FOXO1和Akt表達影響較少，而磷酸化的表達升高;在胞質和胞核中，含藥血清使FOXO1的表達降低，磷酸化表達升高，抑制劑LY294002使FOXO1和p-FOXO1表達均降低。在基因檢測中發現含藥血清使Akt表達升高，FOXO1表達降低，抑制劑使FOXO1表達降低，結果與Western blotting結果相似。這提示降糖消渴顆粒含藥血清可通過PI3K/AKT/FOXO1通路促進FOXO1磷酸化出核以抑制FOXO1核轉錄，實現保護胰島B細胞的作用。

參考文獻

[1] Worldwide trends in diabetes since 1980：a pooled analysis of 751 population-based studies with 4.4 million participants[J].Lancet，2016，387（10027）：1513-1530.

[2]GBD 2015 Risk Factors Collaborators.Global，regional，and national comparative risk assessment of 79 behavioural，environmental and occupational，and metabolic risks or clusters of risks，1990-2015：a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015[J].Lancet，2016，388（10053）：1659-1724.

[3]Cinti F，Bouchi R，Kim-Muller JY，et al.Evidence of β-Cell Dedifferentiation in Human Type 2 Diabetes[J].J Clin Endocrinol Metab，2016，101（3）：1044-1054.

[4]Biggelaar LJ，Eussen SJ，Sep SJ，et al.Associations of Dietary Glucose，Fructose，and Sucrose with β-Cell Function，Insulin Sensitivity，and Type 2 Diabetes in the Maastricht Study[J].Nutrients，2017，9（4）.pii：E380.

[5]高思華，龔燕冰，倪青，等.肝脾腎同治法辨證治療2型糖尿病的臨床研究[J].中華中醫藥雜志，2009，24（8）：1007-1010.

[6]莫芳芳，劉海霞，華靜，等.降糖消渴顆粒含藥血清對INS-1細胞FoxO1表達的影響[J].世界中醫藥，2017，12（12）：3046-3049.

[7]趙丹丹，穆倩倩，方心，等.降糖消渴顆粒含藥血清對C2C12細胞胰島素抵抗的影響[J].中華中醫藥雜志，2014，29（5）：1577-1579.

[8]Cao B，Zhang Z，Zhang Y，et al.Effect of Smilax china L.-containing serum on the expression of POLD1 mRNA in human hepatocarcinoma SMMC-7721 cells[J].Exp Ther Med，2013，6（4）：1070-1076.

[9]Potente M，Urbich C，Sasaki K，et al.Involvement of Foxo transcription factors in angiogenesis and postnatal neovascularization[J].J Clin Invest，2005，115（9）：2382-2392.

[10] Baracho GV，Cato MH，Zhu Z，et al.PDK1 regulates B cell differentiation and homeostasis[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2014，111（26）：9573-9578.

[11]Folli F，Okada T，Perego C，et al.Altered insulin receptor signalling and β-cell cycle dynamics in type 2 diabetes mellitus[J].PLoS One，2011，6（11）：e28050.

[12]Kim-Muller JY，Zhao S，Srivastava S，et al.Metabolic inflexibility impairs insulin secretion and results in MODY-like diabetes in triple FoxO-deficient mice[J].Cell Metab，2014，20（4）：593-602.

[13]Liu P，Kao TP，Huang H.CDK1 promotes cell proliferation and survival via phosphorylation and inhibition of FOXO1 transcription factor[J].Oncogene，2008，27（34）：4733-4744.

[14]Anuradha R，Saraswati M，Kumar KG，et al.Apoptosis of beta cells in diabetes mellitus[J].DNA Cell Biol，2014，33（11）：743-748.

[15]Martinez SC，Cras-Méneur C，Bernal-Mizrachi E，et al.Glucose regulates Foxo1 through insulin receptor signaling in the pancreatic islet beta-cell[J].Diabetes，2006，55（6）：1581-1591.