壯通飲對冠心病模型大鼠心功能及血管舒縮功能的影響

張世田 龐路路 唐漢慶 黃小珊 馮悅 黃岑漢

摘 要 目的：觀察壯通飲水提物對冠心病（CHD）模型大鼠心功能及血管舒縮功能的影響及其可能機制。方法：將SD大鼠隨機分為對照組、假手術組、模型組、陽性組（復方丹參滴丸，0.08 g/kg）以及壯通飲水提物低、中、高劑量組（6.8、13.6、27.2 g/kg，以水提物浸膏質量計），每組10只。除對照組（不手術）和假手術組（只開胸不結扎）外，其余各組大鼠均通過結扎左心室回旋支末梢建立CHD模型。造模1周后，對照組、假手術組和模型組大鼠均灌胃等體積水，各給藥組大鼠均灌胃相應藥物;每日1次，連續4周。末次給藥2 h后，檢測各組大鼠心功能指標[左室舒張末期容積（LVEDV）、左室收縮末期容積（LVESV）、每搏量（SV）、左室射血分數（LVEF）]，采用酶聯免疫吸附測定法檢測其心肌組織炎癥因子[C反應蛋白（CRP）、白細胞介素1β（IL-1β）、干擾素γ（IFN-γ）]和內皮素1（ET-1）水平，采用蘇木精-伊紅染色法觀察其心肌組織形態學特征。結果：對照組和假手術組大鼠心肌纖維結構清晰、排列整齊，兩組大鼠各項指標比較差異均無統計學意義（P>0.05）。與對照組比較，模型組大鼠心肌纖維排列紊亂，可見斷裂、溶解、壞死等現象，并伴有炎癥細胞浸潤，其LVEDV、LVESV以及CRP、IL-1β、ET-1、IFN-γ水平均顯著升高，SV、LVEF均顯著下降（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠上述癥狀均有不同程度的改善，其中陽性組大鼠LVEDV、LVESV和CRP、IL-1β、ET-1、IFN-γ水平，壯通飲水提物中、高劑量組大鼠LVEDV以及壯通飲水提物各劑量組大鼠LVESV和CRP、IL-1β、ET-1、IFN-γ水平均顯著降低，陽性組大鼠SV、LVEF，壯通飲水提物各劑量組大鼠SV以及壯通飲水提物中、高劑量組大鼠LVEF均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。結論：壯通飲水提物可通過作用于炎癥環節而降低ET-1水平，從而改善CHD模型大鼠的血管舒縮功能，恢復其心肌組織血液供應，改善其心功能。

關鍵詞 壯通飲;水提物;冠心病;心功能;血管舒縮功能;炎癥因子;內皮素1;大鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To observe the effects of Zhuangtongyin （ZTY） water extract on blood vessels diastolic and systolic function and cardiac function in rats with coronary heart disease （CHD） and its potential mechanism. METHODS： SD rats were randomly divided into control group， sham operation group， model group， positive group （Compound danshen dripping pills， 0.08 g/kg） and ZTY water extract low-dose， medium-dose and high-dose groups （6.8， 13.6， 27.2 g/kg， by weight of water extract）， with 10 rats in each group. Except for control group （no operation） and sham operation group （only open chest without ligation）， CHD model were set up in other groups by ligating the left ventricle cyclotron endings. One week after modeling， control group， sham operation group and model group were given constant volume of water intragastrically， and administration groups were given relevant medicine intragastrically; once a day， for consecutive 4 weeks. Two hours after last administration， cardiac function indexes （LVEDV， LVESV， SV， LVEF） of rats were detected in each group. The levels of inflammatory factors （CRP， IL-1β， IFN-γ and ET-1） in myocardial tissue were determined by ELISA. Histomorphological characteristics of myocardial tissue were determined by HE staining. RESULTS： The structure of myocardial fibers in control group and sham operation group was clear and orderly; there was no statistical significance in difference of each index between 2 groups （P>0.05）. Compared with control group， myocardial fibers were disorderly arranged in model group， and the phenomena of rupture， dissolution and necrosis were observed， accompanied by infiltration of inflammatory cells. The levels of LVEDV and LVESV as well as the levels of CRP， IL-1β， ET-1 and IFN-γ were increased significantly， while the levels of SV and LVEF were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， above symptoms of rats in each administration group were improved to different extents; the levels of LVEDV and LVESV as well as the levels of CRP， IL-1β， ET-1 and IFN-γ in positive group， the levels of LVEDV in ZTY water extract medium-dose and high-dose groups， the levels of LVESV and CRP， IL-1β， ET-1， IFN-γ in ZTY water extract groups were decreased significantly. The levels of SV and LVEF in positive group， the levels of SV in ZTY water extract groups as well as the levels of LVEF in ZTY water extract medium-dose and high-dose groups were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： ZTY water extract could reduce the level of ET-1 and improve blood vessels diastolic and systolic function in CHD model rats， then restore blood supply of myocardial tissue and strengthen cardiac function， by acting on inflammation cycle.

KEYWORDS? ?Zhuangtongyin; Water extract; Coronary heart disease; Cardiac function; Blood vessels diastolic and systolic function; Inflammatory factor; ET-1; Rat

冠心病（Coronary heart disease，CHD）是由于心肌纖維缺血缺氧致心泵功能受損的疾病，需要恢復血液供應以維持正常的能量和物質代謝。內皮素1（ET-1）作為血管舒縮功能相關因子，具有很強的促血管平滑肌收縮作用[1-2]。當CHD發生時，機體ET-1水平升高，血管發生強烈收縮，使得心臟微細血管舒縮功能紊亂、心肌缺血加劇，是CHD進展和心力衰竭加重的重要病理環節[3]。近年來研究表明，C反應蛋白（CRP）、白細胞介素1β（IL-1β）以及干擾素γ（IFN-γ）等炎癥因子均可影響ET-1的表達，為CHD治療藥物的研發提供了新的候選分子靶點[4-6]。

壯通飲是廣西壯族醫藥的經驗方，由扶芳藤、參三七、黃花倒水蓮等3味藥材組成，具有活血化瘀、通經活絡的功效，可用于心血管疾病[7]、血栓腦梗[8]、高脂血癥[9]等癥的治療，療效較好，但關于其活血化瘀的分子生物學機制研究不多。為此，本研究通過建立CHD動物模型，以壯通飲為干預藥物，觀察該方對模型動物血管心功能以及舒縮功能相關因子ET-1、炎癥因子（CRP、IL-1β、IFN-γ）表達的影響，初步探討其治療CHD的可能機制，旨在為該癥的臨床治療尋找新的靶點。

1 材料

1.1 儀器

V-100型小動物呼吸機（上海玉研科學儀器有限公司）;Vivid 7型彩色多普勒超聲診斷儀（美國GE公司）;AD340型酶標儀（美國Beckman Coulter公司）;077526型心電圖機（上海光電醫用電子儀器有限公司）;RM2245型切片機（上海萊卡顯微系統有限公司）;AE160型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）;TEC2602型恒溫烘片機（意大利Histo-Line公司）;SM-250D型超聲波勻漿儀（南京舜瑪儀器設備有限公司）;CK41-32PH型顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 藥材

扶芳藤飲片（廣西仁濟堂中藥飲片有限公司，批號：151101）、參三七飲片（江西樟樹天齊堂有限公司，批號：20131023）、黃花倒水蓮飲片（廣西張益堂中藥飲片有限公司，批號：1602092）經右江民族醫學院基礎醫學院李克明副教授鑒定分別為衛矛科植物扶芳藤[Euongmus fortunei（Turez.）Hand.-Mazz.]的莖葉、五加科植物參三七[Panax notoginseng（Burk）F. H. Chen]的干燥根、遠志科植物黃花倒水蓮[Polygala aureocauda Dunn]的根。

1.3 藥品與試劑

注射用青霉素鈉（華北制藥股份有限公司，批號：D0801320，規格：80萬單位）;復方丹參滴丸（陽性對照，天士力醫藥集團股份有限公司，批號：151115，規格：薄膜衣滴丸每丸重27 mg）;CRP、IL-1β酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號分別為1321362318、1345316165）;ET-1、IFN-γ ELISA檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為20170726、20180332）;蘇木精、伊紅染色試劑（上海藍季科技發展有限公司，批號分別為A10034、A10022）;其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.4 動物

SPF級SD大鼠70只，雌雄各半，9～10周齡，體質量170～195 g，由右江民族醫學院實驗動物中心提供，動物使用許可證號：SYXK桂2017-0004。所有大鼠均分籠常規飼養，自由飲食、飲水。

2 方法

2.1 壯通飲水提物的制備

取扶芳藤、參三七、黃花倒水蓮飲片各適量，粉碎，過50目篩，按處方量以質量比6 ∶ 3 ∶ 4混合，用10倍量（g/mL）水煎煮，濾過。濾液置于水浴鍋中，蒸干，即得壯通飲水提物浸膏（每100克藥材得浸膏60 g）。臨用前，將上述浸膏用水稀釋，得質量濃度為2.72 g/mL（按水提物浸膏質量計）的藥液，備用。

2.2 分組、造模與給藥

采用隨機數字表法將大鼠隨機分為對照組、假手術組、模型組、陽性組（復方丹參滴丸，0.08 g/kg，以水為溶劑;劑量根據臨床成人用量換算而得）以及壯通飲水提物低、中、高劑量組（6.8、13.6、27.2 g/kg，以水提物浸膏質量計，以水為溶劑;劑量設置參考文獻[10]），每組10只。參考文獻[11]及本課題組前期實驗方法復制CHD大鼠模型：除對照組外，其余各組大鼠均腹腔注射10%水合氯醛溶液（3.5 mL/kg）進行麻醉，連接小動物呼吸機進行機械輔助通氣（呼吸頻率：80次/min，潮氣量：30～40 mL/kg，呼吸時間比：1 ∶ 1），并進行心電圖監護。大鼠經左側開胸后，暴露心臟，辨認并結扎左心室回旋支末梢，直至觀察到結扎下方心肌顏色逐漸變為灰白色（即缺血發生）且心電圖出現S-T段抬高0.2 mm或者出現增高、增寬的QRS波，即表明結扎成功。縫合切口后，置籠中飼養，并于大鼠大腿肌內注射青霉素鈉80萬單位（每日1次，連續3 d）以預防感染。假手術組只開胸不結扎，其余操作同上。術后1周，對照組、假手術組、模型組大鼠均灌胃等體積水，各給藥組大鼠均灌胃相應藥物;每日1次，連續4周。

2.3 心功能檢測

于末次給藥2 h后，采用彩色多普勒超聲診斷儀（探頭頻率：2.5 MHz）測量各組大鼠的左室舒張末期容積（LVEDV）、左室收縮末期容積（LVESV）、每搏量（SV）、左室射血分數（LVEF），觀察并記錄至少3個心動周期的數據，取其平均值作為檢測結果。

2.4 心肌組織CRP、IL-1β、ET-1、IFN-γ水平檢測

取缺血區心肌組織（對照組和假手術組大鼠取對應左心室心尖部分組織，下同）50 mg，加入4 ℃生理鹽水適量，超聲（功率：250 W，頻率：20 kHz）勻漿，于4 ℃下以4 000 r/min離心10 min，取上清液，置于-20 ℃低溫保存，待檢。采用ELISA法以酶標儀檢測各組大鼠心肌組織中CRP、IL-1β、ET-1、IFN-γ水平。嚴格按照相應試劑盒說明書操作。

2.5 心肌組織形態學觀察

取缺血區心肌組織適量，以生理鹽水洗凈，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常規乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片（厚度約5 μm），經脫蠟、復水后，行蘇木精-伊紅（HE）染色、乙醇梯度脫水、二甲苯透明，以中性樹脂封片后，使用顯微鏡觀察各組大鼠心肌組織形態學特征并拍照。

2.6 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用Tukey’s或Dunnett’s t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 壯通飲水提物對大鼠心功能的影響

與對照組比較，模型組大鼠LVEDV、LVESV均顯著升高，SV、LVEF均顯著下降，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）;而假手術組大鼠上述指標與對照組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。與模型組比較，陽性組大鼠LVEDV、LVESV，壯通飲水提物中、高劑量組大鼠LVEDV以及壯通飲水提物各劑量組大鼠LVESV均顯著降低，陽性組大鼠SV、LVEF，壯通飲水提物各劑量組大鼠SV以及壯通飲水提物中、高劑量組大鼠LVEF均顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01），詳見表1。

3.2 壯通飲水提物對大鼠心肌組織CRP、IL-1β、ET-1、IFN-γ水平的影響

與對照組比較，模型組大鼠心肌組織CRP、IL-1β、ET-1、IFN-γ水平均顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.01）;而假手術組大鼠上述指標與對照組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。與模型組比較，陽性組及壯通飲水提物各劑量組大鼠上述指標均顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01），詳見表2。

3.3 壯通飲水提物對大鼠心肌組織形態學特征的影響

對照組和假手術組大鼠心肌纖維結構清晰，排列規則，界限分明，染色均勻，細胞核清晰可見，未見滲液或炎癥細胞浸潤。模型組大鼠心肌組織染色不均，心肌纖維排列紊亂，可見斷裂和淡染，局部出現溶解、壞死、滲出、腫脹等現象，并伴有炎癥細胞浸潤。與模型組比較，陽性組和壯通飲水提物各劑量組大鼠心肌纖維溶解、壞死、滲出等癥狀均有不同程度的減輕，炎癥細胞浸潤均有所減少，詳見圖1。

4 討論

CHD是由于冠狀動脈病變、心臟血液供應不足、心肌組織缺血缺氧等因素所致的心功能受損，其中冠狀動脈粥樣硬化是該癥最主要的致病因素;由于心肌組織缺血缺氧，導致代謝產物潴留，不僅會對心肌纖維造成損傷，還會對為心肌纖維供血的微細血管造成損害[12]。冠狀動脈以粥樣硬化病變多見，其發生機制與氧化應激、炎癥反應、脂質沉積等有關，一般認為與上述因素共同作用有關[13]。因此，有效防治冠狀動脈粥樣硬化可作為CHD臨床治療的有效途徑之一。

CHD致心肌缺血很大程度上歸因于心臟微細血管舒縮功能紊亂[14]。ET-1由心肌細胞、平滑肌細胞、血管內皮細胞等合成、分泌，具有很強的促血管平滑肌收縮作用，是調節血管舒縮功能的重要因子[1-2]。作為判斷CHD嚴重程度和冠狀動脈狹窄程度的新標志物，ET-1受到了學者的廣泛關注[15]。有研究指出，炎癥反應及相關炎癥因子可上調血管ET-1的表達，其中CRP和IFN-γ均可刺激心肌細胞、平滑肌細胞、血管內皮細胞分泌ET-1，可引起血管收縮、痙攣，加重心肌組織缺血缺氧[16];IL-1β是一種促炎因子，主要由巨噬細胞、淋巴細胞或肥大細胞分泌，在募集白細胞、增加毛細血管壁通透性等方面具有積極作用，其水平的上升也可引起ET-1表達的增加[17]。此外，為排除手術的不利影響，本研究同時設定了對照組和假手術組。結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠心功能指標出現異常，且心肌纖維排列紊亂，可見斷裂和淡染、溶解、壞死、滲出、腫脹等現象，并伴有炎癥細胞浸潤，提示CHD致心肌缺血損害了大鼠的心泵功能;而假手術組大鼠上述指標與對照組比較無明顯差異，提示手術操作不會對大鼠相關指標造成影響。此外，ELISA檢測結果顯示，模型組大鼠心肌組織CRP、IL-1β、IFN-γ水平均顯著升高，ET-1水平也隨之升高，提示大鼠血管收縮明顯增強。升高的ET-1可反饋性地加重心肌局部組織的缺血缺氧，形成惡性循環，進而加重疾病進展[3]。由此可見，恢復血管的正常舒縮功能以恢復血液供應可能是CHD的治療靶點之一。

壯通飲由扶芳藤、參三七、黃花倒水蓮等3味廣西特色壯藥配伍而成。其中，扶芳藤壯名“Gaeuciengaen”，別名“巖青杠”“萬年青”“爬墻虎”等，具有補腎強筋、通經活血的功效，能明顯降低全血比黏度，改善微循環;參三七壯名“Gosamcaet”，別名“田七”“山漆”“金不換”“血參”等，具有活血止血、化瘀止痛、補益肝腎等功效，是最為常用的活血化瘀壯藥;黃花倒水蓮壯名“Gosinhvahenj”，別名“黃花參”“雞仔樹”“黃花遠志”等，具有活血止血、祛濕解毒、補虛消腫的功效以及抗應激損傷的作用，也是常用的活血化瘀壯藥[18]。壯通飲用于心腦血管疾病的治療效果較好，但對其具體起效機制的相關研究較少。復方丹參滴丸由丹參、三七、冰片等藥材組成，具有活血化瘀、理氣止痛之功效，且具有用量小、作用強、療效好、不良反應少的優點，是臨床常用的中藥制劑，廣泛用于CHD、心絞痛、心力衰竭等疾病的治療，故本研究將其作為陽性對照[19]。同時，考慮到該方多以水煎劑給藥，故本研究以壯通飲水提物為受試藥物，初步考察了該方對CHD模型大鼠心功能以及CRP、IFN-γ、IL-1β、ET-1水平的影響。結果顯示，低、中、高劑量的壯通飲均可不同程度地改善CHD模型大鼠的心功能，減輕其心肌纖維溶解、壞死、炎癥細胞浸潤等癥狀，且與模型組比較，陽性組大鼠LVEDV、LVESV和CRP、IFN-γ、IL-1β、ET-1水平，壯通飲水提物中、高劑量組大鼠LVEDV，壯通飲水提物各劑量組大鼠LVESV和CRP、IFN-γ、IL-1β、ET-1水平均顯著降低;陽性組大鼠SV、LVEF，壯通飲水提物各劑量組大鼠SV以及壯通飲中、高劑量組大鼠LVEF均顯著升高，提示壯通飲水提物對CHD模型大鼠具有一定的改善作用。此外本研究還發現，壯通飲水提物不同劑量對上述指標的影響并不存在量效關系，可能與低劑量藥效不足而高劑量難以重復吸收利用等因素有關[20]，其具體用藥劑量尚有待進一步確認。

綜上所述，壯通飲水提物可通過作用于炎癥環節而降低ET-1水平，從而改善CHD模型大鼠的血管舒縮功能，恢復其心肌組織血液供應，改善其心功能。但本研究尚未對模型大鼠的血液流變學指標進行探討，故后續研究將進一步予以完善。

參考文獻

[ 1 ] ROCHA NP，COLPO GD，BRAVO-ALEGRIA J，et al. Exploring the relationship between endothelin-1 and peripheral inflammation in multiple sclerosis[J]. J Neuroimmunol，2018. DOI：10.1016/j.jneuroim.2018.11.007.

[ 2 ] MIYAUCHI T，SAKAI S. Endothelin and the heart in hea- lth and diseases[J]. Peptides，2019. DOI：10.1016/j.peptides.2018.10.002.

[ 3 ] 田小超，孫冠嬰，何偉亮，等.葶藶生脈方對充血性心力衰竭大鼠ET-1、NO/NOS的影響[J].河北中醫藥學報，2018，33（5）：4-6、20.

[ 4 ] 梁科，許峰，趙偉.不同劑量瑞舒伐他汀對外周動脈粥樣硬化癥患者踝肱指數及超敏C反應蛋白的影響[J].中國醫院用藥評價與分析，2018，18（12）：1624-1626.

[ 5 ] 韓永麗，吳松，陳松，等.電針內關預處理對心肌缺血再灌注模型大鼠TNF-α、IL-1β與MKK3/6-p38MAPK通路的影響[J].遼寧中醫雜志，2018，45（12）：2645-2648.

[ 6 ] YAO Y，JEYANATHAN M，HADDADI S，et al. Induction of autonomous memory alveolar macrophages requires T cell help and is critical to trained immunity[J].Cell，2018，175（6）：1634-1650.

[ 7 ] 陳曉鋒，曾祥發.壯通飲對內源性神經干細胞的研究進展[J].陜西中醫，2013，34（4）：504-505.

[ 8 ] 陳曉鋒，王婧婧.壯通飲治療恢復期腦梗死60例臨床觀察[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2013，11（8）：959- 960.

[ 9 ] 劉燕平，黃岑漢.壯通飲治療濁脂瘀阻型高脂血癥56例[J].陜西中醫，2009，30（2）：169-170.

[10] 黃娟萍，羅裕，江力，等.中藥藥動學研究中給藥劑量的現狀分析[J].中國藥學雜志，2012，47（21）：1685-1689.

[11] 張世田，龐路路，唐漢慶，等.大鼠心肌缺血模型制備方法的比較及改進淺析[J].中國比較醫學雜志，2017，27（7）：98-101.

[12] 王祖剛.活血化瘀法治療冠心病20例服藥前后血乳酸指標的觀察[J].光明中醫，2003，18（1）：36-37.

[13] 張世田，唐漢慶，黃岑漢，等.氧化應激、炎癥與冠狀動脈粥樣硬化關系的研究進展[J].右江醫學，2017，45（2）：235-239.

[14] 董武松，李馨欣，楊俊.內皮素1在心血管系統中的作用[J].國際心血管病雜志，2012，39（3）：153-156.

[15] CHEN J，CHEN MH，GUO YL，et al. Plasma big endothelin-1 level and the severity of new-onset stable coronary artery disease[J]. J Atheroscler Thromb，2015，22（2）：126-135.

[16] 揭育麗，唐蘭芬.缺氧缺血新生大鼠腦組織中氧自由基脂類含量的變化[J].中國熱帶醫學，2005，5（9）：1818-1820.

[17] GONG Z，ZHAO S，ZHOU J，et al. Curcumin alleviates DSS-induced colitis via inhibiting NLRP3 inflammsome activation and IL-1β production[J]. Mol Immunol，2018. DOI：10.1016/j.molimm.2018.09.004.

[18] 梁啟成，鐘鳴.中國壯藥學[M].南寧：廣西民族出版社，2005：270、400、432.

[19] 李倩.復方丹參滴丸研究進展及臨床應用[J].中華中醫藥雜志，2018，33（7）：2989-2991.

[20] 孫平良，耿曙光，袁代解，等.安腸湯對潰瘍性結腸炎大鼠腸黏膜組織中內源性代謝物的影響[J].中醫雜志，2016，57（19）：1678-1683.

（收稿日期：2019-01-11 修回日期：2019-06-10）

（編輯：張元媛）