正交設計優化雙斛膠囊的總多糖水提取工藝

單冰冰 陳寬 李婷 田富月 張建永

摘 要 目的：優化雙斛膠囊總多糖的水提取工藝。方法：對雙斛膠囊組方藥材金釵石斛和鐵皮石斛混合物在以醇提取總生物堿之后進行水提取總多糖。以葡萄糖為對照品，采用硫酸-苯酚法顯色處理并在488 nm波長處檢測，測定總多糖含量。以干膏得率和總多糖含量計算的綜合評分為評價指標，采用單因素試驗考察料液比、提取溫度、提取時間和提取次數對提取效果的影響;根據單因素試驗考察結果，采用L9（34）正交表進行設計和試驗，進一步優化料液比、提取溫度、提取時間、提取次數等條件，并對所得優化工藝進行驗證試驗。結果：葡萄糖質量濃度在0.041 4～0.207 0 mg/mL范圍內與吸光度的線性關系良好（r=0.999 9）;日內、日間RSD為3.61%～8.24%（n=3、n=5），重復性試驗RSD為1.49%（n=6）;平均加樣回收率為98.65%（RSD=1.45%，n=6）。優化后的水提取工藝為料液比1 ∶ 25（g/mL）、提取溫度100 ℃、提取時間90 min、提取1次;3次驗證試驗結果顯示，優化工藝所得水提物的平均總多糖含量為379.292 8 mg/g（RSD=1.93%，n=3）、平均干膏得率為22.75%（RSD=2.41%，n=3）。結論：所建立的硫酸-苯酚法簡便，精密度、準確度均良好;優化所得的水提取工藝穩定、可行，可用于雙斛膠囊總多糖的提取。

關鍵詞 雙斛膠囊;金釵石斛;鐵皮石斛;總多糖;硫酸-苯酚法;含量測定;干膏得率;正交試驗;工藝優化

ABSTRACT? OBJECTIVE： To optimize the water extraction technology of total polysaccharide of Shuanghu capsules. METHODS： The total alkaloid was firstly extracted from Dendrobium nobile and Dendrobium officinale mixture of Shuanghu capsules with ethanol， and then total polysaccharide was extracted with water. Using glucose as control， total polysaccharide was treated with phenol-sulfuric acid method and its content was determined at 488 nm. Using comprehensive score calculated with the yield of the extract and the content of total polysaccharide as index， the effects of material-liquid ratio， extraction temperature， extraction time and times on the extraction were investigated by single factor test. Then L9（34） orthogonal test was used to optimize solid-liquid ratio，extraction temperature，extraction time and extraction times according to the results of single factor test. The optimized technology was validated. RESULTS： The linear range of glucose were 0.041 4-0.207 0 mg/mL（r=0.999 9）. RSDs of intra-day and inter-day ranged 3.61%-8.24% （n=3，n=5）， and RSD of repeatability test was 1.49% （n=6）. Average recovery rate was 98.65%（RSD=1.45%，n=6）. The optimal water extraction technology included solid-liquid ratio of 1 ∶ 25（g/mL），extraction temperature of 100 ℃，extracting for 90 min， extracting once. Results of validation tests showed that average content of total polysaccharide was 379.292 8 mg/g （RSD=1.93%，n=3） and average yield of the extract was 22.75%（RSD=2.41%，n=3）. CONCLUSIONS： Established phenol-sulphuric acid method is simple， precise and accurate. The optimal water extraction technology is stable and feasible， which can be used for the extraction of total polysaccharides from Shuanghu capsules.

KEYWORDS? ?Shuanghu capsules; Dendrobium nobile; Dendrobium officinale; Total polysaccharide; Phenol-sulphuric acid method; Content determination; Yield of extract; Orthogonal test; Technology optimization

流行病學調查結果顯示，我國飲酒人群比例和酒精性肝病發病率均呈上升趨勢，酒精性肝病已成為我國最主要的慢性肝病之一，其可導致機體多系統、多器官損傷，危害不容小覷[1]。酒精性肝病最基本的病理狀態是酒精性肝損傷（Alcoholic liver disease，ALD），ALD貫穿于酒精性肝病發生的始終[2]。但目前ALD的發病機制尚未闡明，西醫治療以戒酒、營養支持及對癥治療為主，尚缺乏特效藥物[3]。中醫辨證論治是中醫理論的精華，其認為ALD是由酒毒濕熱之邪熏蒸肝膽，致痰濁凝聚、肝失調達、氣血郁滯、脾胃損傷。雖然中醫學者和醫家尚未對ALD的辨證進行統一，但治法多以清熱化濕、理氣化瘀、補益肝腎為主[4-6]。因此，如能在辨證論治的指導原則下，結合現代藥理學研究成果，可更有針對性地選擇藥物，使患者獲得更好的療效。

目前，藥用石斛屬植物共有40多種，其中金釵石斛和鐵皮石斛備受關注[7]。2015年版《中國藥典》（一部）收錄了金釵石斛（Dendrobium nobile Lindl.）和鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo），兩者均具有益胃生津、滋陰清熱之功效[8]。石斛性甘、微寒，歸肺、胃、腎經，為常用貴重藥材，藥用歷史悠久，《神農本草經》將其列為上品，可用于熱病津傷、口干煩渴、胃陰不足和陰虛火旺等多種病癥的治療[9]。現代藥理學研究表明，石斛具有護肝、抗胃潰瘍、降血糖、提高免疫力等作用[10-11]。上述藥用歷史和藥理學成果均佐證了石斛可對ALD發揮治療作用。金釵石斛和鐵皮石斛的主要活性指標成分為生物堿和多糖[12]，石斛生物堿可緩解高脂血癥大鼠肝臟脂肪變性等癥狀[13-14]，而石斛多糖則在調節受酒精影響的肝功能和脂質代謝等方面發揮著重要作用[15-16]，這兩類成分均對肝臟有一定的保護和調節作用，其藥理作用既存在差異又相互關聯，從現代藥理學角度推測兩者配伍可能會發揮協同功效。

基于中醫辨證論治的整體觀，不局限于某一客觀指標的改變，本課題組以金釵石斛和鐵皮石斛的優勢成分總生物堿和總多糖作為活性成分，通過現代提取和制劑手段，制成一種對亞急性ALD具有改善作用的雙斛膠囊。該制劑根據2015年版《中國藥典》（一部）中成人日服用量[8]，將金釵石斛和鐵皮石斛的用量均以4 g（兩種藥材質量比為1 ∶ 1）進行配伍后提取制得。其提取工藝主要分為兩個步驟：首先對金釵石斛和鐵皮石斛的混合物進行醇提取獲得總生物堿成分，再將藥渣進行水提取獲得總多糖成分。本課題組前期已完成雙斛膠囊總生物堿的醇提取工藝的優化（另文刊出），現以總多糖含量和干膏得率為指標，采用正交設計優化雙斛膠囊總多糖的水提取工藝，為該制劑的深入開發提供依據和參考。

1 材料

1.1 儀器

BT125D型十萬分之一電子分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司];FA2004N型電子天平（上海菁海儀器有限公司）;TU-1900型紫外-分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）;AXTGL16M型高速冷凍離心機（鹽城市安信試驗儀器有限公司）;HH-6型數顯恒溫水浴鍋（上海上登實驗設備有限公司）;FW135型中藥材粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）;XH-B型旋渦混合器（姜堰市康健醫療器具有限公司）;BCD-579WE型冰箱（青島海爾股份有限公司）。

1.2 藥品與試劑

葡萄糖對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：0833-9501，純度：100.0%）;無水乙醇（成都金山化學試劑有限公司）;濃硫酸（國藥集團化學試劑有限公司）;苯酚（上海阿拉丁生化股份有限公司）;其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

金釵石斛、鐵皮石斛飲片由重慶市渝和堂藥業有限公司提供，均產自云南，批號均為20170801。兩者經質檢全部符合2015年版《中國藥典》（一部、四部）“中藥材與飲片”項下石斛和鐵皮石斛的性狀、鑒別及含量測定有關規定，以及“中藥其他方法”項下浸出物測定、雜質檢查、灰分測定、二氧化硫殘留量測定等有關規定。

2 雙斛膠囊的總多糖含量測定

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液 取葡萄糖對照品適量，精密稱定，加水制成質量濃度為0.207 0 mg/mL的對照品母液;取該母液，以水逐級稀釋成相應質量濃度的對照品溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液 稱取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物（按質量比1 ∶ 1混勻，過30目篩，以下同）8 g，置于圓底燒瓶中，按前期研究篩選的最佳醇提工藝提取總生物堿（以下同）。取醇提后的藥渣，加水回流提取（具體參數見本文后續正交試驗優選水提取工藝），放冷，用少量水分次洗滌容器并用紗布過濾水提液和洗液;合并濾液，置于2 000 mL量瓶中，加水定容，搖勻;以3 500 r/min離心15 min，移取上清液1 mL，加入5倍體積的80%乙醇，于4 ℃冷藏1 h后，再于4 ℃下以3 500 r/min離心15 min;取沉淀，用4倍體積的80%乙醇繼續洗滌，以3 500 r/min離心15 min，棄去上清液，重復操作2次;取沉淀，加少量熱水溶解，放冷，再加水定容至10 mL，搖勻，即得。

2.2 檢測波長的選擇

取“2.1”項下制備的對照品溶液（0.124 2 mg/mL）和供試品溶液，采用硫酸-苯酚法[8，17]進行顯色反應：向對照品溶液或供試品溶液中加入5%苯酚溶液0.5 mL（臨用時配制），搖勻，再精密加入濃硫酸2.5 mL，搖勻;室溫放置5 min后，置沸水浴中加熱20 min進行顯色反應，取出，置于冰水浴中降溫5 min終止反應。以水為空白溶劑對照，采用紫外分光光度計在400～600 nm波長范圍內進行光譜掃描。結果，兩種溶液均在488 nm波長處有最大吸收峰，故選擇488 nm作為測定波長，詳見圖1。

2.3 方法學考察

2.3.1 顯色穩定性考察 稱取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物8 g，平行3份，提取總生物堿后取藥渣，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下硫酸-苯酚法“加入5%苯酚溶液0.5 mL……置于冰水浴中降溫5 min終止反應”步驟處理，分別于處理完畢后第0、30、60、120、240 min時，在488 nm波長處測定吸光度。結果顯示，不同時間點樣品吸光度的RSD為0.49%（n=5），表明供試品溶液在顯色后的240 min內穩定。

2.3.2 線性關系考察 精密量取“2.1.1”項下對照品母液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分別置于刻度試管中，以水稀釋至0.5 mL，制成葡萄糖質量濃度分別為0.041 4、0.082 8、0.124 2、0.165 6、0.207 0 mg/mL的系列對照品溶液，按“2.2”項下硫酸-苯酚法進行顯色反應。以水為空白溶劑對照，在488 nm波長處測定吸光度。以葡萄糖質量濃度（X，mg/mL）為橫坐標、吸光度值（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為Y=3.929 4X+0.001（r=0.999 9）。結果表明，葡萄糖質量濃度在0.041 4～0.207 0 mg/mL范圍內與吸光度的線性關系良好。

2.3.3 精密度試驗 稱取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物8 g，提取總生物堿后取藥渣，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，于4? ℃保存。分別于3個不同工作日和每個工作日第0、4、8、12、24 h時，取該供試品溶液，按“2.2”項下硫酸-苯酚法處理后測定，并以外標法計算總多糖含量，分別考察日間與日內精密度。結果，總多糖含量日間RSD為8.24%（n=3），日內RSD分別為3.61%、7.50%、5.05%（n=5），表明供試品溶液在日間（1～3 d）和日內（0～24 h）均較不穩定，故該供試品溶液需現配現用。

2.3.4 重復性試驗 稱取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物8 g，平行6份，提取總生物堿后取藥渣，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下硫酸-苯酚法處理后測定，以外標法計算總多糖含量。結果，總多糖含量的RSD為1.49%（n=6），表明該方法的重復性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 稱取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物4 g，平行6份，提取總生物堿后取藥渣，分別加入16.639 2 mg/mL的葡萄糖對照品濃溶液（按“2.1.1”項下對照品母液配制方法新配）100 mL，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下硫酸-苯酚法處理后測定，以外標法計算總多糖含量及加樣回收率。結果，樣品中總多糖的平均加樣回收率為98.65%，RSD為1.45%（n=6），表明該方法準確度良好，詳見表1。

3 雙斛膠囊的總多糖提取工藝優化

3.1 提取工藝的單因素考察

參照文獻方法[18-19]并結合預試驗結果，本研究以綜合評分法（以總多糖含量和干膏得率計算）進行單因素試驗。總多糖含量測定按“2”項下方法進行。取按“2.1.2”項下方法提取獲得的總多糖水提液樣品200 mL，置于105 ℃恒質量的蒸發皿中，90 ℃水浴蒸干，然后在105 ℃烘箱中干燥3 h，再轉移至干燥器中冷卻30 min，稱定質量并計算干膏得率。設定總多糖含量權重為7分、干膏得率權重為3分（合計10分）依據，按公式計算綜合評分：綜合評分=（總多糖含量/總多糖含量最大值）×7+（干膏得率/干膏得率最大值）×3。

3.1.1 料液比的考察 稱取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物8 g，提取總生物堿后取藥渣，固定提取溫度為90 ℃、提取時間為60 min、提取次數為1次，按藥材的原質量分別以料液比1 ∶ 25、1 ∶ 30、1 ∶ 35、1 ∶ 40、1 ∶ 45（g/mL，下同）加水，進行加熱回流提取，平行操作3次。按前述方法測定總多糖含量和干膏得率，計算綜合評分，結果見圖2A。由圖2A可知，綜合評分在料液比為1 ∶ 25～1 ∶ 30范圍內時呈上升趨勢，且在料液比為1 ∶ 30時達到最大值，隨后呈下降趨勢。綜合以上因素，選擇料液比為1 ∶ 25～1 ∶ 35進行后續正交試驗考察。

3.1.2 提取溫度的考察 稱取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物8 g，提取總生物堿后取藥渣，固定料液比為1 ∶ 30（按藥材原質量計）、提取時間為60 min、提取次數為1次，分別在60、70、80、90、100 ℃加熱條件下進行回流提取，平行操作3次。按前述方法測定總多糖含量和干膏得率，計算綜合評分，結果見圖2B。由圖2B可知，當提取溫度在60～80 ℃時，綜合評分變化不大，趨于平緩;當提取溫度為80～100 ℃時，綜合評分上升較快，在100 ℃條件下綜合評分達最高值（由于實驗室條件有限，未繼續考察更高的溫度）。綜合以上因素，選擇提取溫度為80～100 ℃進行后續正交試驗考察。

3.1.3 提取時間的考察 稱取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物8 g，提取總生物堿后取藥渣，固定料液比為1 ∶ 30（按藥材原質量計）、提取溫度為100 ℃、提取次數為1次，分別加熱回流提取30、60、90、120、150 min，平行操作3次。按前述方法測定總多糖含量和干膏得率，計算綜合評分，結果見圖2C。由圖2C可知，當提取時間為90 min時，綜合評分最高;雖然當提取時間在150 min以上時綜合評分也有上升趨勢，但考慮到時間成本和能源消耗，并未繼續選擇更長的提取時間進行比較。綜合以上因素，選擇提取時間為60～120 min進行后續正交試驗考察。

3.1.4 提取次數的考察 稱取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物8 g，提取總生物堿后取藥渣，固定料液比為1 ∶ 30（按藥材原質量計）、提取溫度為100 ℃、提取總時間為90 min，分別加熱回流提取1、2、3、4次，平行操作3次。按前述方法測定總多糖含量和干膏得率，計算綜合評分，結果見圖2D。由圖2D可知，當提取1～3次時，綜合評分差異不大，但提取4次時綜合評分有下降趨勢。綜合以上因素，選擇提取次數為1～3次進行后續正交試驗考察。

3.2 正交試驗優化提取工藝

3.2.1 正交試驗考察 根據單因素試驗結果，以料液比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）、提取次數（D）為影響因素，采用L9（34）正交表進行設計和試驗，平行操作3次，按前述方法測定總多糖含量和干膏得率，計算綜合評分，并以綜合評分作為評價指標。因素與水平見表2，正交試驗設計與結果見表3，方差分析結果見表4。

由表3、表4可知，因素水平A1B3C2D1對提取工藝影響相對較大，其中以離差平方和最小的因素項（D）為誤差項進行方差分析，根據極值（R）大小，確定A因素（料液比）對提取工藝的影響最大，各因素對綜合評分影響的順序為A>C>B>D;除A因素對工藝的影響有統計學意義外，其余因素的影響均無統計學意義。綜合考慮提取效率和試驗條件等因素，結合單因素考察結果，確定總多糖水提取工藝的最佳工藝條件為A1B3C2D1，即料液比為1 ∶ 25（g/mL）、提取溫度為100 ℃、提取時間為90 min、提取1次。

3.2.2 驗證試驗 稱取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物8 g，提取總生物堿后取藥渣，按“3.2.1”項下最佳工藝條件進行水提取及干燥，平行操作3次。按前述方法測定并計算水提物樣品中的總多糖含量和干膏得率。結果，平均總多糖含量為379.292 8 mg/g（RSD=1.93%，n=3），平均干膏得率為22.75%（RSD=2.41%，n=3），表明優選水提取工藝條件穩定、合理、可行。

4 討論

多糖是一種結構復雜的生物大分子，是由多個單糖分子縮合形成糖苷鍵，并以糖苷鍵進行線性或分枝連接而成的糖類化合物，是許多中藥如靈芝、人參等中的活性成分[20]。目前，多糖提取方法有加熱提取法、微波提取法、超聲波輔助水提法、酶解輔助提取法等[21]。但多糖經過超聲或微波處理后其糖苷鍵可能會發生斷裂;酶解輔助提取法雖然提取率較高，但酶反應條件要求嚴格，會增加生產成本，且目前尚停留在實驗室研究階段，暫不能直接用于工廠規模化生產[22]。本研究采用的水提取法是目前最常用的多糖提取方法，工藝條件簡單、易控制。綜合考慮石斛藥材的昂貴價格，從降低生產成本的角度，本課題組對雙斛膠囊的2種組方藥材中的兩類主要成分采用先醇提取總生物堿，然后水提取總多糖的步驟進行提取。本研究是在前期醇提取總生物堿的優化提取工藝確定后，對其藥渣進行總多糖的水提工藝優化研究，旨在最大程度地保留2種石斛藥材的有效成分。

目前，多糖含量的測定方法一般有比色法、滴定法、高效液相色譜法等，其中比色法應用最廣泛，主要包括硫酸-苯酚法、硫酸蒽酮法和3，5-二硝基水楊酸法等[20，23]。多糖比色法抗干擾能力較弱，藥材的不同產地、對照品的選擇、反應溫度和時間等因素都會對多糖含量測定結果產生一定的干擾[20，23]。故本研究參考文獻中報道較多的石斛多糖含量測定方法[24-25]，以葡萄糖為對照品，采用硫酸苯酚法進行多糖含量測定，并對含量測定方法進行方法學驗證。結果顯示，供試品溶液的日間精密度和日內精密度RSD值均偏大，提示經硫酸、苯酚處理后的水提液樣品穩定性不佳，因此應盡快完成提取工藝的操作，減少存儲等外界條件對總多糖含量的干擾，并且供試品溶液需現配現用，以確保其有效成分的穩定。

本研究對醇提取總生物堿后的藥渣進行水提取工藝考察，首先通過單因素試驗初步確定料液比、提取溫度、提取時間、提取次數對總多糖含量和干膏得率（以兩者計算的綜合評分為評價指標）的影響。在單因素考察結果的基礎上進行正交設計優化，確定各因素對綜合評分的影響程度排序為料液比>提取時間>提取溫度>提取次數，其中料液比對綜合評分的影響最為顯著（P<0.05）。綜合考慮其他因素，如提取溫度越高時多糖含量越高、不同提取時間條件下綜合評分差異不大、提取次數增多會對后續濃縮干燥帶來諸多不便等情況，最終確定最佳水提取工藝為料液比1 ∶ 25（g/mL）、提取溫度100 ℃、提取時間90 min、提取1次。經驗證試驗表明，該提取工藝穩定、可行，可為雙斛膠囊的下一步開發利用奠定良好的基礎。

綜上所述，本研究所建立的硫酸苯酚法簡便，精密度、準確度均良好;優化所得的水提取工藝穩定、可行，可用于雙斛膠囊總多糖的提取。

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（收稿日期：2019-05-07 修回日期：2019-08-07）

（編輯：段思怡）