基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)治療乳腺增生的作用機(jī)制探討

吳代陸 麥喆钘 陳怡 陳寶艷 張璐 孫治中 孫偉鵬 黃梅

摘 要 目的：挖掘“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)治療乳腺增生的活性成分、靶點(diǎn)及通路，全面系統(tǒng)地探究其潛在作用機(jī)制。方法：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過(guò)TCMSP、DRAR-CPI、Genecards、OMIM等數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)的主要活性成分及其治療乳腺增生的潛在作用靶標(biāo);采用Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建活性成分-潛在作用靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)和潛在作用靶標(biāo)的相互作用網(wǎng)絡(luò)，并篩選出5個(gè)潛在核心靶標(biāo)，以分子對(duì)接法驗(yàn)證其與活性成分的結(jié)合親和性。對(duì)潛在作用靶標(biāo)進(jìn)行基因本體和KEGG通路富集分析，獲得關(guān)鍵通路，進(jìn)而構(gòu)建活性成分-潛在作用靶標(biāo)-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果：共獲得“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)的活性成分17個(gè)、活性成分-潛在作用靶標(biāo)47個(gè)。共獲得核心靶標(biāo)5個(gè)，包括絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1、α型蛋白激酶C、C型蛋白激酶、轉(zhuǎn)化蛋白p21、磷脂酰肌醇4，5-二磷酸3-激酶催化亞基α亞型，pi3 -激酶亞基α等;主要涉及5個(gè)信號(hào)通路，包括絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路、磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶通路、小G蛋白通路、雌激素通路、骨形態(tài)發(fā)生蛋白通路。結(jié)論：“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)治療乳腺增生不僅具有通過(guò)多成分作用于多靶標(biāo)的特點(diǎn)，而且會(huì)通過(guò)潛在作用靶標(biāo)之間的相互影響發(fā)揮復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)作用。

關(guān)鍵詞 柴胡;白術(shù);藥對(duì);乳腺增生;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);靶標(biāo);通路;機(jī)制

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To screen the active component， target and pathway of couplet medicine of “Bupleuri Radix- Atractylodis macrocephalea Rhizoma”， and to comprehensively explore its potential mechanism. METHODS： Based on the method of network pharmacology， main active componets and potential targets of? couplet medicine of “Bupleuri Radix-A. macrocephalea Rhizoma” were retrieved from TCMSP， DRAR-CPI， Genecards and OMIM database. The active component-potential target network and interaction network of potential targets were established by Cytoscape 3.6.0 software. Five potential core targets were screened， and its affinity with active components were validated with molecule docking method. GO classified enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis of potential targets were carried out to obtain key pathway so as to construct active component-potential target-key pathway network. RESULTS： Totally 17 active components and 47 active component-potential targets were obtained from couplet medicine of “Bupleuri Radix-A. macrocephalea Rhizoma”. Five core targets were obtained， including AKT1， PRKCA， PRKCE， HRas， and PIK3CA. Five signaling pathways were involved， including MAPK pathway， PI3K/AKT pathway， RAS pathway， Estrogen pathway， BMP pathway. CONCLUSIONS： The couplet medicine of “Bupleuri Radix-A. macrocephalea Rhizoma” not only act on multiple targets through multiple components for mammary hyperplasia， but also play a complex network regulation role through the interaction between potential targets.

KEYWORDS? ?Bupleuri Radix; Atractylodis macrocephalea Rhizoma; Couplet medicine; Mammary hyperplasia; Network pharmacology; Target; Pathway; Mechanism

乳腺增生又稱為乳腺結(jié)構(gòu)不良，是指乳腺上皮組織和纖維組織增生，乳腺組織導(dǎo)管和乳腺小葉在結(jié)構(gòu)上的退行性病變及進(jìn)行性結(jié)締組織的生長(zhǎng)[1-3]。其發(fā)病率居乳房疾病的首位，臨床主要癥狀表現(xiàn)為乳房彌散性結(jié)節(jié)和疼痛[4-5]。流行病學(xué)資料顯示，有70%～80%的女性患有不同程度的乳腺增生，且多見于25～45歲的女性，其癌變率約為10%～20%[6-7]，給患者生理和心理健康帶來(lái)了嚴(yán)重的危害。

乳腺增生疾病最早見于漢代華佗著《中藏經(jīng)》，稱為“乳癖”。中醫(yī)認(rèn)為其發(fā)病病機(jī)主要是肝氣郁結(jié)導(dǎo)致肝脾兩傷、痰氣互結(jié)，氣血雙虧導(dǎo)致氣血瘀滯[8]。同時(shí)，現(xiàn)代臨床研究也發(fā)現(xiàn)，肝氣郁結(jié)是乳腺增生的常見發(fā)病機(jī)制[9]。因此，對(duì)于乳腺增生，中醫(yī)的主要治法是疏肝健脾療法，以達(dá)到調(diào)理肝脾、舒暢氣機(jī)的目的。“柴胡-白術(shù)”是疏肝健脾療法中的常用藥對(duì)，本課題組通過(guò)臨床實(shí)踐觀察發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)治療乳腺增生可取得良好的效果[10]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，以柴胡、白術(shù)為君臣藥組方的逍遙散對(duì)雌性小鼠具有擬雌激素樣作用，可增加正常小鼠子宮的質(zhì)量，提高其雌二醇水平;而對(duì)于某些由于雌激素過(guò)高導(dǎo)致的疾病，如乳腺增生和子宮肌瘤，逍遙散又能發(fā)揮拮抗雌激素的作用，降低血清中雌二醇水平，并調(diào)節(jié)孕酮含量[11-12]。因此，本團(tuán)隊(duì)認(rèn)為“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)對(duì)雌激素水平具有雙向調(diào)節(jié)作用，這可能與其治療乳腺增生的作用機(jī)制相關(guān)。然而，目前對(duì)“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)的藥理作用機(jī)制研究尚不夠深入，即使有較多關(guān)于其抗乳腺增生方面的機(jī)制研究，卻只停留在該藥對(duì)調(diào)節(jié)內(nèi)分泌以及改善乳腺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)層面，而關(guān)于該藥對(duì)如何減輕乳腺組織對(duì)高濃度雌激素的反應(yīng)，調(diào)節(jié)血清中雌激素、孕酮、雌二醇水平等機(jī)制尚未闡明，也未對(duì)該藥對(duì)中的有效成分在體內(nèi)抗乳腺增生的多靶點(diǎn)整合協(xié)同作用機(jī)制進(jìn)行深入探討。

一般認(rèn)為，中藥具有“多成分、多靶點(diǎn)、低親和力、低選擇性”的作用特點(diǎn)[13]，所以使用現(xiàn)代藥理學(xué)理論闡述中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制一直是研究的難點(diǎn)和關(guān)鍵點(diǎn)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)理論對(duì)生物系統(tǒng)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，選取特定信息節(jié)點(diǎn)進(jìn)行多靶點(diǎn)藥物分子設(shè)計(jì)的新學(xué)科，其融合了系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)、生物信息學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)等多學(xué)科的技術(shù)和內(nèi)容，能夠進(jìn)行“疾病表型-基因-靶點(diǎn)-藥物”等多層次網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，探索藥物與疾病間的關(guān)聯(lián)性，闡明藥物作用機(jī)制[14]。其整體性、系統(tǒng)性及復(fù)雜性的研究角度和研究方法，正好與中醫(yī)藥的作用特點(diǎn)相符合[15]。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，以“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)中具有抗乳腺增生作用的主要活性成分為研究對(duì)象，通過(guò)構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，全面系統(tǒng)地預(yù)測(cè)和挖掘其作用靶點(diǎn)，同時(shí)結(jié)合基因本體（Gene ontology，GO）分類富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，對(duì)“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)治療乳腺增生的潛在作用機(jī)制進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，以期為該藥對(duì)的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分的獲取

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），分別以“柴胡”“白術(shù)”“Bupleurum”“Atractylodes”等為中英文關(guān)鍵詞，以O(shè)B值（口服吸收度）≥30%、DL值（類藥性）≥0.18[16]為限定條件檢索，獲得該藥對(duì)具有抗乳腺增生作用的活性成分。

1.2 藥物活性成分的預(yù)測(cè)靶標(biāo)及對(duì)應(yīng)基因的獲取

利用Chembiodraw Ultra 12.0軟件繪制“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)活性成分的3D結(jié)構(gòu)圖，并將其結(jié)構(gòu)文件上傳至DRAR-CPI服務(wù)器（https：//omictools.com/drar-cpi-tool），選取“Z-score<-0.5”的蛋白[17]，剔除重復(fù)部分后，將所得結(jié)果作為“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)活性成分的預(yù)測(cè)靶標(biāo)。在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/）中輸入各預(yù)測(cè)靶標(biāo)的具體名稱，限定物種為“Human”，獲取預(yù)測(cè)靶標(biāo)的對(duì)應(yīng)基因。

1.3 “柴胡-白術(shù)”藥對(duì)治療乳腺增生的潛在作用靶標(biāo)的獲取

分別以“Hyperplasia of mammary glands”“Mammary hyperplasia”“Breast hyperplasia”為關(guān)鍵詞，在Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.omim.org/）中檢索獲得乳腺增生的疾病相關(guān)靶標(biāo)及其對(duì)應(yīng)基因。采用Excel 2013軟件錄入所獲疾病相關(guān)靶標(biāo)和“1.2”項(xiàng)下獲得的“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)活性成分預(yù)測(cè)靶標(biāo)的對(duì)應(yīng)基因，并進(jìn)行兩者對(duì)比，篩選出交集部分，根據(jù)交集基因篩選出對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)，作為“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)治療乳腺增生的潛在作用靶標(biāo)（下文中均以非斜體的基因名代表其對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)）。

1.4 活性成分-潛在作用靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將“1.3”項(xiàng)下獲得的“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)活性成分治療乳腺增生的潛在作用靶標(biāo)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件，構(gòu)建活性成分-潛在作用靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)圖直觀展示活性成分與潛在作用靶標(biāo)之間的關(guān)系，并分析“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)治療乳腺增生的作用特點(diǎn)。

1.5 潛在作用靶標(biāo)的相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將“1.3”項(xiàng)下獲得的“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)活性成分治療乳腺增生的潛在作用靶標(biāo)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org），將物種限定為“Homo sapiens”，獲取潛在作用靶標(biāo)的相互作用關(guān)系。將該關(guān)系文件導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件，繪制潛在作用靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)，并利用Cytoscape 3.6.0軟件中的“NetworkAnalyzer”工具對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，獲取潛在作用靶標(biāo)之間的連接度（Degree值），并根據(jù)Degree值繪制最終的潛在作用靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 核心靶標(biāo)的篩選及驗(yàn)證

基于“1.5”項(xiàng)下構(gòu)建的潛在作用靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)，篩選出Degree值最高的5個(gè)靶標(biāo)（即網(wǎng)絡(luò)圖上節(jié)點(diǎn)面積最大的5個(gè)節(jié)點(diǎn)），作為潛在核心靶標(biāo)，并進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。將潛在核心靶標(biāo)導(dǎo)入SystemsDock Web Site服務(wù)器（http：//systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index）與“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)的活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，得到兩者之間的對(duì)接評(píng)分（Docking Score）。當(dāng)對(duì)接評(píng)分<4.25，則表示活性成分分子和潛在核心靶標(biāo)具有較弱的結(jié)合親和性;對(duì)接評(píng)分為4.25～<5.0，則表示兩者之間具有一定的結(jié)合親和性;對(duì)接評(píng)分為5.0～<7.0，則表示兩者之間具有較強(qiáng)的結(jié)合親和性;對(duì)接評(píng)分≥7.0則表示兩者之間具有很強(qiáng)的結(jié)合親和性[18]。根據(jù)對(duì)接評(píng)分≥4.25的活性成分所占比例評(píng)價(jià)上述5個(gè)潛在核心靶標(biāo)與活性成分之間的結(jié)合親和性，進(jìn)而驗(yàn)證潛在核心靶標(biāo)的真實(shí)性。

1.7 “柴胡-白術(shù)”藥對(duì)治療乳腺增生相關(guān)生物學(xué)過(guò)程與通路分析

將“1.3”項(xiàng)下獲取的潛在作用靶標(biāo)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/），選擇“Select identifier”為“Official gene symbol”、“List type”為“Gene list”、物種為“Human”，進(jìn)行GO分類富集分析和KEGG通路富集分析。GO分類富集分析結(jié)果包括分子功能（Molecular function，MF）、生物過(guò)程（Biological process，BP）和細(xì)胞組分（Cellular component，CC）三部分。對(duì)所獲得的P<0.001[19]的生物學(xué)過(guò)程與通路，根據(jù)富集靶標(biāo)數(shù)量由多到少進(jìn)行排序，再選取富集靶標(biāo)數(shù)量最多的前10條生物學(xué)過(guò)程與通路，作為本研究的主要分析對(duì)象。結(jié)合相關(guān)研究文獻(xiàn)對(duì)該10條通路進(jìn)行分析，篩選出可能與治療乳腺增生相關(guān)的通路，作為關(guān)鍵通路。

1.8 活性成分-潛在作用靶標(biāo)-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)獲取富集于“1.7”項(xiàng)所獲關(guān)鍵通路上的潛在作用靶標(biāo)，并與相應(yīng)的活性成分相匹配，得出三者之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，并采用Cytoscape 3.6.0軟件繪制活性成分-潛在作用靶標(biāo)-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)，直觀地展現(xiàn)“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)治療乳腺增生的成分、靶標(biāo)、通路三者之間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，多方面闡釋該藥對(duì)治療乳腺增生的作用機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 “柴胡-白術(shù)”藥對(duì)活性成分獲取結(jié)果

共檢索獲得“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)活性成分17個(gè)，其中柴胡活性成分13個(gè)、白術(shù)活性成分4個(gè)，主要包括乙酸芳樟酯、黃芩苷、3β-乙酸化蒼術(shù)酮、 8β-乙氧基白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ等，詳見表1。

2.2 活性成分-潛在作用靶標(biāo)的獲取結(jié)果

根據(jù)DRAR-CPI服務(wù)器檢索結(jié)果，共獲得“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)活性成分的預(yù)測(cè)靶標(biāo)128個(gè);與Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的乳腺增生的疾病相關(guān)靶標(biāo)進(jìn)行對(duì)比取交集后，共篩選出“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)治療乳腺增生的活性成分-潛在作用靶標(biāo)47個(gè)，詳見表2。

2.3 活性成分-潛在作用靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)治療乳腺增生的活性成分-潛在作用靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖見圖1。由圖1可見，該網(wǎng)絡(luò)上有節(jié)點(diǎn)64個(gè)、邊線257條，其中六邊形節(jié)點(diǎn)代表“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)活性成分，圓形節(jié)點(diǎn)代表潛在作用靶標(biāo)，邊線代表兩者的相互關(guān)聯(lián)。由該網(wǎng)絡(luò)圖可知，同一活性成分可以作用于不同靶標(biāo)，而同一靶標(biāo)也可對(duì)應(yīng)不同活性成分，體現(xiàn)出“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)能通過(guò)多成分、多靶標(biāo)發(fā)揮抗乳腺增生作用的特點(diǎn)。

2.4 潛在作用靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

潛在作用靶標(biāo)的相互作用網(wǎng)絡(luò)見圖2。由圖2可見，該相互作用網(wǎng)絡(luò)上共有節(jié)點(diǎn)47個(gè)、邊線352條，其中圓形節(jié)點(diǎn)代表潛在作用靶標(biāo)，邊線代表各靶標(biāo)之間的相互關(guān)聯(lián)。根據(jù)該網(wǎng)絡(luò)圖可知，潛在作用靶標(biāo)之間存在復(fù)雜的相互作用關(guān)系，因此本團(tuán)隊(duì)推測(cè)“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)治療乳腺增生不僅是通過(guò)多成分作用于多靶標(biāo)來(lái)發(fā)揮網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)作用，還可能會(huì)通過(guò)潛在作用靶標(biāo)之間的相互影響，進(jìn)而產(chǎn)生了復(fù)雜的調(diào)節(jié)關(guān)系，發(fā)揮治療作用。

2.5 核心靶標(biāo)的篩選及驗(yàn)證結(jié)果

由圖2可見，潛在核心靶標(biāo)（即節(jié)點(diǎn)面積最大的5個(gè)節(jié)點(diǎn)）分別為PRKCE、PRKCA、AKT1、PIK3CA、HRas。上述靶標(biāo)與“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)的17個(gè)活性成分的分子對(duì)接結(jié)果顯示，PRKCE、PRKCA與15個(gè)活性成分（均占88.2%）具有一定或更強(qiáng)的結(jié)合親和性，AKT1、PIK3A、HRas與14個(gè)活性成分（均占82.4%）具有一定或更強(qiáng)的結(jié)合親和性，詳見表3。由此可見，潛在核心靶標(biāo)與“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)活性成分的結(jié)合親和性均較強(qiáng)，提示本研究對(duì)潛在核心靶標(biāo)的預(yù)測(cè)具有一定的科學(xué)性，因此將上述5個(gè)靶標(biāo)作為在“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)治療乳腺增生過(guò)程中發(fā)揮廣泛而重要作用的核心靶標(biāo)。

2.6 GO分類富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果

GO分類富集分析結(jié)果顯示，“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)治療乳腺增生主要涉及蛋白結(jié)合、三磷酸腺苷（ATP）結(jié)合、酶結(jié)合、促進(jìn)RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄、信號(hào)傳導(dǎo)、促進(jìn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)膜等多個(gè)方面，詳見表4～表6。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（PI3K/AKT）信號(hào)通路、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）信號(hào)通路、小G蛋白（RAS）信號(hào)通路、乙型肝炎信號(hào)通路等與“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)治療乳腺增生的潛在靶標(biāo)具有顯著相關(guān)性，詳見表7。

2.7 活性成分-潛在作用靶標(biāo)-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

將關(guān)鍵通路與“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)的活性成分、潛在作用靶標(biāo)一一對(duì)應(yīng)，構(gòu)建活性成分-潛在作用靶標(biāo)-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)，詳見圖3。其中，矩形節(jié)點(diǎn)代表藥物，菱形節(jié)點(diǎn)代表活性成分，圓形節(jié)點(diǎn)代表潛在作用靶標(biāo)，六邊形節(jié)點(diǎn)代表作用通路。由該網(wǎng)絡(luò)可知，“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)治療乳腺增生涉及活性成分共17個(gè)，包括異鼠李素、槲皮素、豆甾醇、黃芩苷、過(guò)蓽澄茄素等;這些活性成分作用的靶標(biāo)主要有包括PRKCE、PRKCA、AKT1、PIK3CA、HRas等47個(gè);上述靶標(biāo)主要涉及PI3K/AKT、雌激素（Estrogen）、RAS、BMP、MAPK等信號(hào)通路。

3 討論

“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)具有疏肝解郁健脾的功效，是中醫(yī)臨床治療乳癖的常用藥對(duì)[10]。近年來(lái)的臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)發(fā)現(xiàn)，該藥對(duì)在乳腺增生類疾病方面療效明確[10]。但目前“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)治療乳腺增生類疾病的具體作用機(jī)制及相關(guān)活性成分尚未明確。為此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的原理和方法，擬深入探究其潛在作用機(jī)制。

本研究共檢索獲得“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)的活性成分17個(gè)，上述成分與乳腺增生的治療可能相關(guān)的作用靶標(biāo)有47個(gè);構(gòu)建了“活性成分-潛在作用靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)，直觀地體現(xiàn)了該藥對(duì)通過(guò)多成分、多靶標(biāo)治療乳腺增生的特點(diǎn);構(gòu)建了潛在作用靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)，反映出該藥對(duì)治療乳腺增生相關(guān)的各靶標(biāo)之間關(guān)系密切，亦印證其作用機(jī)制較為復(fù)雜多樣;通過(guò)分子對(duì)接驗(yàn)證了“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)的活性成分和核心靶標(biāo)之間結(jié)合親和性較強(qiáng)，表明本研究對(duì)PRKCE、PRKCA、AKT1、PIK3CA、HRas在治療過(guò)程中發(fā)揮核心作用的推測(cè)具有一定科學(xué)性。

3.1 “柴胡-白術(shù)”藥對(duì)活性成分的藥理作用

本研究獲得“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)中如異鼠李素、槲皮素、黃芩苷、過(guò)蓽澄茄素、豆甾醇等17個(gè)活性成分，結(jié)合已有研究，本團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)異鼠李素、槲皮素、黃芩苷在治療乳腺疾病中具有重要作用。例如，文月玲等[20]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可減輕由脂多糖誘發(fā)的家兔乳腺炎的進(jìn)展，降低家兔血清中的乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、髓過(guò)氧化物酶和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的活性，減少血清中IL-1、IL-6和TNF-α的表達(dá)，同時(shí)能減輕炎性發(fā)熱，從而發(fā)揮保護(hù)乳腺組織的作用。胡珊等[21]研究發(fā)現(xiàn)，異鼠李素可通過(guò)抑制PI3K/AKT通路和膜受體酪氨酸蛋白激酶信號(hào)通路的活性來(lái)發(fā)揮抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的作用，同時(shí)可以通過(guò)下調(diào)抑凋亡因子Bcl-2的表達(dá)、上調(diào)促凋亡因子Bax的表達(dá)來(lái)減少乳腺的過(guò)度增生，達(dá)到抗乳腺癌的目的。Seo HS等[22]通過(guò)研究認(rèn)為，高濃度的槲皮素作為一種植物激素，主要可通過(guò)上調(diào)胱天蛋白酶8（Caspase-8）、Caspase-3蛋白的水平，誘導(dǎo)多聚核糖聚合酶的裂解，促進(jìn)外源性凋亡的發(fā)生，從而抑制乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。

基于此，本團(tuán)隊(duì)認(rèn)為“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)治療乳腺增生主要是通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)、減緩臨床癥狀，同時(shí)抑制乳腺細(xì)胞的過(guò)度增生、減緩病情進(jìn)展，甚至通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮逆轉(zhuǎn)性的治療作用。

3.2 核心靶標(biāo)的治療意義

本研究結(jié)果顯示，“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)可能主要通過(guò)作用于PRKCE、PRKCA、AKT1、PIK3CA、HRas 等5個(gè)靶標(biāo)來(lái)發(fā)揮治療乳腺增生的作用。相關(guān)研究結(jié)果表明，下調(diào)PRKCE活性可使乳腺細(xì)胞的易感性增強(qiáng)，如增強(qiáng)內(nèi)源性或外源性凋亡信號(hào)對(duì)乳腺細(xì)胞凋亡的調(diào)控以及增強(qiáng)其對(duì)電離輻射和細(xì)胞毒性藥物的敏感性，這與乳腺增生密切相關(guān)[23]。PRKCA和PIK3CA表達(dá)的抑制可減緩體內(nèi)乳腺細(xì)胞的異常增長(zhǎng)，而PIK3CA過(guò)表達(dá)亦可損害乳腺細(xì)胞DNA，增強(qiáng)乳腺細(xì)胞的易感性，促進(jìn)乳腺細(xì)胞凋亡，達(dá)到抑制乳腺增生的效果[24]。AKT1可產(chǎn)生刺激細(xì)胞增殖或降低雌激素受體依賴性的作用，影響雌激素受體磷酸化，從而造成內(nèi)分泌環(huán)境紊亂，導(dǎo)致乳腺增生[25]。HRas基因的突變會(huì)導(dǎo)致乳腺上皮細(xì)胞的異常生長(zhǎng)，提高乳腺增生的發(fā)生率，是乳腺增生的危險(xiǎn)因素[26]。上述靶標(biāo)均與乳腺增生的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，提示“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)可能通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)靶點(diǎn)，起到治療乳腺增生的作用。

基于此，本團(tuán)隊(duì)認(rèn)為“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)可通過(guò)抑制PRKCE、PRKCA、PIK3CA的表達(dá)，增強(qiáng)乳腺細(xì)胞的易感性，促進(jìn)乳腺細(xì)胞的凋亡;同時(shí)，可增強(qiáng)其他抗腫瘤藥物對(duì)乳腺細(xì)胞的殺傷作用，從而達(dá)到抑制乳腺增生的治療效果。其次，該藥對(duì)可通過(guò)抑制AKT1的表達(dá)，減少雌激素受體磷酸化的發(fā)生，調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)分泌紊亂的情況，達(dá)到減緩乳腺增生進(jìn)展的目的。此外，該藥對(duì)還可能通過(guò)降低HRas基因的突變率，抑制乳腺上皮細(xì)胞的異常增殖，從而發(fā)揮預(yù)防乳腺增生或防止其惡化的作用。

3.3 關(guān)鍵通路的相關(guān)機(jī)制

綜合既往研究結(jié)果，本團(tuán)隊(duì)認(rèn)為“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)治療乳腺增生的作用可能通過(guò)雌激素通路、PI3K/AKT、RAS、BMP、MAPK等信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，乳腺增生的發(fā)生與內(nèi)分泌環(huán)境的紊亂有很大關(guān)系。目前研究發(fā)現(xiàn)，雌激素受體信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)乳腺的生長(zhǎng)、發(fā)育及細(xì)胞凋亡等一系列生理活動(dòng)有調(diào)控效應(yīng)，雌激素受體信號(hào)通路失調(diào)可促進(jìn)乳腺細(xì)胞過(guò)度增殖或抑制乳腺細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致乳腺增生[27]。PI3K/AKT/mTOR為PI3K/AKT通路下游眾多通路中的一條，研究發(fā)現(xiàn)，該通路被激活后，被激活的AKT會(huì)直接磷酸化mTOR，發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)，從而促進(jìn)乳腺細(xì)胞增殖[28]。有研究證實(shí)，RAS基因傳遞細(xì)胞生長(zhǎng)分化信號(hào)，催化活性區(qū)的突變，導(dǎo)致RAS蛋白不依賴于表皮生長(zhǎng)因子受體/酪氨酸激酶型細(xì)胞表面受體（EGFR/HER）激化，促成細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[29]。孫麗等[30]研究發(fā)現(xiàn)，BMP2和BMP4的表達(dá)上調(diào)會(huì)促進(jìn)乳腺干細(xì)胞的增殖和分化，從而導(dǎo)致乳腺導(dǎo)管數(shù)量增加、分支增多，繼而致使乳腺上皮增生。MAPK信號(hào)通路包括ERK1/2、JNK、p38 MAPK等3條通路，其主要功能是將細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，多項(xiàng)研究證實(shí)，MAPK信號(hào)通路在乳腺細(xì)胞增殖、分化、凋亡及轉(zhuǎn)移中有重要的調(diào)節(jié)作用，影響著乳腺增生等多種乳腺疾病的發(fā)生[31-32]。

基于此，本團(tuán)隊(duì)考慮“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)是通過(guò)雌激素通路維持雌激素受體的穩(wěn)定性，使雌激素發(fā)揮正常的生理功能，維持乳腺的正常生長(zhǎng)、發(fā)育及凋亡;同時(shí)其能阻斷PI3K/AKT/mTOR通路，抑制抗凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)，促進(jìn)乳腺細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮抑制乳腺增生的作用。對(duì)于RAS信號(hào)通路在乳腺增生中的治療作用，本課題組推斷其主要是減少了乳腺細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及增生，從而起到預(yù)防乳腺增生及惡化的作用。此外，“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)還可通過(guò)阻斷BMP信號(hào)通路，抑制BMP相關(guān)蛋白的表達(dá)，減少乳腺干細(xì)胞的增殖與分化;該藥對(duì)還可通過(guò)調(diào)控MAPK通路，阻止細(xì)胞外的增殖信號(hào)傳導(dǎo)至乳腺細(xì)胞內(nèi)，發(fā)揮抑制乳腺細(xì)胞增殖的作用，同時(shí)促進(jìn)凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)，增加乳腺細(xì)胞的凋亡，從而起到治療乳腺增生的效果。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究結(jié)果表明，“柴胡-白術(shù)”藥對(duì)治療乳腺增生的過(guò)程涉及了多個(gè)活性成分、作用靶標(biāo)及生物過(guò)程，其作用機(jī)制復(fù)雜多樣，并非只由單個(gè)成分、單個(gè)靶標(biāo)或單個(gè)通路發(fā)揮作用，這與中藥治療疾病的特點(diǎn)相吻合。分子對(duì)接結(jié)果亦驗(yàn)證了本研究結(jié)果的可靠性，本文所得結(jié)論能與現(xiàn)有實(shí)證研究結(jié)果相符。但本研究結(jié)果只是一種分子機(jī)制上的預(yù)測(cè)探討，該藥對(duì)治療乳腺增生的具體作用機(jī)制仍需通過(guò)進(jìn)一步研究予以驗(yàn)證。

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（收稿日期：2019-03-06 修回日期：2019-07-28）

（編輯：段思怡）