小葉三點金提取物的抗炎作用及其機制研究

蘇華珍 唐秀能 魏江存 馬家寶 陳勇 梁麗清 江先再 韓倩

摘 要 目的：研究小葉三點金提取物的抗炎作用及其機制，為該藥用植物的進一步開發應用提供實驗依據。方法：采用二甲苯、冰醋酸、角叉菜膠建立小鼠急性炎癥模型，以地塞米松為陽性對照（0.005 g/kg），考察灌胃不同劑量小葉三點金提取物（50、30、15 g/kg）對二甲苯致正常小鼠和腎上腺摘除小鼠耳腫脹、冰醋酸致正常小鼠腹腔毛細血管通透性增加、角叉菜膠致正常小鼠和腎上腺摘除小鼠足腫脹的抑制作用，并對角叉菜膠致炎模型腎上腺摘除小鼠足趾炎性部位中的丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）水平進行檢測;另設空白組小鼠為對照（灌胃等體積水）。結果：與空白組比較，小葉三點金提取物高、中劑量組正常小鼠和腎上腺摘除小鼠耳腫脹度均顯著降低，而耳腫脹抑制率顯著升高;小葉三點金提取物各劑量組正常小鼠腹腔毛細血管通透性均顯著降低;小葉三點金提取物高、中劑量組正常小鼠和腎上腺摘除小鼠足腫脹度均顯著降低，而足腫脹抑制率顯著升高（P<0.05或P<0.01）;小葉三點金提取物高、中劑量組腎上腺摘除小鼠足趾炎性部位中MDA、NO水平均顯著降低，SOD水平均顯著升高（P<0.05）。結論：小葉三點金提取物對小鼠急性炎癥有明顯抑制作用;其抗炎作用機制與降低MDA、NO水平并提高SOD水平有關，且該抗炎作用的發揮不依賴于下丘腦-垂體-腎上腺軸系統。

關鍵詞 小葉三點金;提取物;抗炎;作用機制;下丘腦-垂體-腎上腺軸系統;小鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the anti-inflammatory effect and its mechanism of the extract of Dcsmodium microphyllum， so as to provide experiment reference for further study of D. microphyllum. METHODS： Acute inflammatory model was established by xylene，glacial acetic acid and carrageenan. Using dexamethasone as positive control （0.005 g/kg）， inhibitory effects of intragastric different doses of the extract of D. microphyllum （50， 30， 15 g/kg） on xylene-induced ear swelling in normal mice and adrenalectomized mice， glacial acetic acid-induced permeability increasing of abdominal capillaries in normal mice， carrageenan-? ?induced paw swelling in normal mice and adrenalectomized mice were investigated. The levels of MDA， SOD and NO in the inflammatory tissue of toes of adrenalectomized mice were detected in carrageenan-induced inflammation model. Blank group was set for control （ig. equal volumn of water）. RESULTS： Compared with blank group， ear swelling degree of normal mice and adrenalectomized mice were decreased significantly in D. microphyllum extract high-dose and medium-dose groups while inhibitory rate of ear swelling was increased significantly; the permeability of abdominal capillaries of normal mice was significantly decreased in D. microphyllum extract groups; the swelling degree of toes in normal mice of D. microphyllum extract high-dose and middle-dose groups and adrenalectomized mice were significantly decreased while inhibitory rate of toe swelling was increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. The levels of MDA and NO in the toe inflammatory site of adrenalectomized mice were decreased significantly in D. microphyllum extract high-dose and medium-dose groups， while the level of SOD was increased significantly （P<0.05）. CONCLUSIONS： D. microphyllum extract can inhibit acute inflammation in mice significantly. Its anti-inflammatory mechanism is associated with decreasing MDA and NO while increasing SOD levels， and the anti-inflammatory effect does not depend on the hypothalamus-pituitary-adrenal axis system.

KEYWORDS? ?Dcsmodium microphyllum; Extract; Anti-inflammation; Mechanism; Hypothalamus-pituitary-adrenal axis system; Mice

小葉三點金為豆科山螞蝗屬植物小葉三點金草[Dcsmodium microphyllum（Thunb.）DC.]，別名“斑鳩窩”“爬地香”“哮靈草”“小葉山綠豆”“辮子草”“碎米柴”等，以其根及全草入藥[1-2]。小葉三點金在民間常用于治療尿路感染、糖尿病、泌尿系結石、慢性胃炎、慢性氣管炎等病癥，具有清熱解毒、健脾利濕、消炎止血、止咳平喘、活血化瘀等功效，也被廣泛用于治療毒蛇咬傷、癰瘡潰爛、漆瘡、痔瘡等[1-5]。已有研究表明，螞蟥屬植物具有良好的抗炎、鎮痛、抗氧化和保護血管等作用[2]。關于小葉三點金中的主要成分黃酮類[6-7]、酚酸類[2]、生物堿類[2]、萜類和甾醇類[8]等有較多研究，然而關于其相關藥理作用及機制的研究鮮有報道。僅有Govindarajan R等[9]研究報道，小葉三點金具有良好的鎮痛、抗炎、抗氧化、保護血管等作用。本課題組通過對小葉三點金的前期預實驗發現，其具有較好的抗炎活性。考慮到該植物抗炎作用及機制的研究報道較少，因此本課題組在前期研究基礎上，考察小葉三點金70%乙醇提取物的抗炎活性并初步探討其作用機制，為該藥用植物的進一步開發應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

GL124-1SCN型電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司];UV-1780型紫外-可見分光光度計[島津儀器（蘇州）有限公司];TGL-16GB型離心機（上海安亭科學儀器廠）;全波長型酶標儀[帝肯（上海）貿易有限公司];BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌器（上海迅博實業有限公司醫療設備廠）;RE-1002型旋轉蒸發儀（常州市國旺儀器制造有限公司）。

1.2 藥品與試劑

醋酸地塞米松片（浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：180119，規格：0.70 mg）;頭孢克肟分散片（浙江莎普愛思藥業股份有限公司，批號：180162E，規格：50 mg）;二甲苯、冰醋酸、伊文思藍（國藥集團化學試劑有限公司，批號分別為F20180618、T20180912、20180725）;角叉菜膠（上海源葉生物科技有限公司，批號：YY18704）;水合氯醛（成都市科龍化工試劑廠，批號：2018020102）;超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）酶聯免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒（批號分別為20180308、20180305、20180316）均購自南京建成生物工程研究所;其余試劑均為分析純或由實驗室自行配制;生理鹽水為0.9%氯化鈉注射液，水為純化水。

1.3 藥材

小葉三點金藥材采自廣西南寧市上林縣，經廣西中醫藥大學藥學院陳勇教授鑒定為豆科山螞蝗屬植物小葉三點金草[Dcsmodium microphyllum（Thunb.）DC.]全草。

1.4 動物

清潔級昆明種小鼠，雄性，體質量18～22 g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK桂2014-0001。小鼠在實驗前于清潔級動物房適應性喂養3 d，環境溫度為（25±1）℃、濕度約為65%、人造光周期為12 h明暗交替。小鼠自由攝食飲水，飼料為標準嚙齒類動物飼料，飲水為純化水。動物飼料、墊料均由廣西醫科大學實驗動物中心提供。

2 方法

參考文獻方法[10-11]進行小葉三點金提取物的抗炎活性作用考察。

2.1 小葉三點金提取物的制備

取小葉三點金藥材5 kg，打成粗粉，以70%乙醇在約82 ℃條件下回流提取3次，每次溶劑倍量分別為12、8、6倍（L/kg），提取時間分別為2、1.5、1 h;濾過，合并濾液，用旋轉蒸發儀在水浴條件下減壓濃縮，然后于55 ℃水浴中揮干溶劑，稱定質量，得率為12.85%。

2.2 二甲苯致小鼠耳腫脹實驗

取小鼠60只，按體質量隨機分為空白組、陽性對照組（地塞米松，0.005 g/kg;劑量根據人給藥劑量換算并結合預實驗結果制定）和小葉三點金提取物高、中、低劑量組（50、30、15 g/kg，以所含原生藥量計算，下同;劑量根據急性毒性實驗與預實驗結果制定），每組12只。各給藥組小鼠分別灌胃給藥（分別將地塞米松片和小葉三點金提取物以水配制成相應藥液），給藥體積均為20 mL/kg，qd，連續給藥7 d;空白組小鼠同法灌胃等體積水。末次給藥1 h后，于小鼠右耳正反兩面各涂抹二甲苯10 μL致炎（劑量根據預實驗結果設定）;15 min后脫頸椎處死小鼠，沿耳根部剪下兩耳，用6 mm打孔器在兩耳相同部位打下等面積圓耳片，稱定質量，計算耳腫脹度及腫脹抑制率。耳腫脹度（mg）=右耳片質量-左耳片質量;耳腫脹抑制率（%）=[（空白組平均耳腫脹度-實驗組平均耳腫脹度）/空白組平均耳腫脹度]×100%。

2.3 冰醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性增加實驗

取小鼠60只，按“2.2”項下方法分組、給藥。末次給藥1 h 后，對各組小鼠尾靜脈注射0.3%伊文思藍溶液10 mL/kg、腹腔注射0.6%冰醋酸溶液10 mL/kg致炎（劑量根據預實驗結果設定）;15 min后脫頸椎處死小鼠，腹腔注射生理鹽水6 mL沖洗腹腔，輕揉其腹部1 min后，剪開腹腔收集腹腔液;腹腔液以3 000 r/min離心12 min，取上清液，采用紫外-可見分光光度計于590 nm波長處測定光密度（OD）。以OD值表示毛細血管通透性，OD值越高則毛細血管通透性越大。

2.4 角叉菜膠致小鼠足腫脹實驗

取小鼠60只，按“2.2”項下方法分組、給藥。末次給藥1 h后，在各組小鼠右后足趾部皮下注射1%角叉菜膠溶液0.02 mL致炎（劑量根據文獻[11]設定）;15 min后脫頸椎處死小鼠，剪取其后雙足趾相同部位，稱定質量，計算小鼠足腫脹度及腫脹抑制率。足腫脹度（mg）=小鼠右后足趾質量-小鼠左后足趾質量;足腫脹抑制率（%）=[（空白組平均足腫脹度-實驗組平均足腫脹度）/空白組平均足腫脹度]×100%。

2.5 二甲苯致腎上腺摘除小鼠耳腫脹實驗

取小鼠60只，于術前1天灌胃頭孢克肟60 mg/kg（以水配制，下同）給藥預防感染。以5%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射麻醉小鼠，剃去背部毛，以70%乙醇消毒皮膚后，在其胸腰椎交界處，沿背部正中線、背肋后緣切一約0.5 cm長的切口，以小鑷子擴大切口并輕輕推開腹腔臟器和組織，輕輕摘除左右兩側腎上腺腺體（腎上腺在脊柱下方腎臟前內側可見，呈淡黃色，與周圍不規則的脂肪組織有明顯區別）。切口以棉球稍止血后縫合肌肉和皮膚，然后涂以碘伏消毒，術后第2天對小鼠灌胃頭孢克肟60 mg/kg，術后3 d內以5%葡萄糖生理鹽水溶液代替水飼養。術后第3天時，按“2.2”項下方法分組、給藥，并進行二甲苯致耳腫脹實驗，計算耳腫脹度及腫脹抑制率。

2.6 角叉菜膠致腎上腺摘除小鼠足腫脹實驗

取小鼠60只，按“2.5”項下方法進行雙側腎上腺摘除手術。術后第3天時，按“2.4”項下方法分組、給藥，并進行角叉菜膠致足腫脹實驗，計算足腫脹抑制率。同時，取其右足足趾炎性部位，剪碎，以生理鹽水4 mL浸泡，冰上勻漿后，以3 000 r/min離心10 min，取上清液于-20 ℃保存。參照相應試劑盒說明書操作，采用ELISA法以酶標儀測定組織中MDA、NO、SOD的水平。

2.7 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件對數據進行統計分析。實驗數據均以x±s表示，采用單因素方差分析，如果方差齊則采用LSD法進行組間比較，方差不齊則用Dunnett’s T3法進行組間比較。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 小葉三點金提取物對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

與空白組比較，陽性對照組和小葉三點金提取物高、中劑量組小鼠耳腫脹度均顯著降低，耳腫脹抑制率均顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）;與陽性對照組比較，小葉三點金提取物低劑量組小鼠耳腫脹度顯著增高，耳腫脹抑制率顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05），而小葉三點金提取物高、中劑量組小鼠耳腫脹度及腫脹抑制率差異均無統計學意義（P>0.05），詳見表1。

3.2 小葉三點金提取物對冰醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性增加的影響

與空白組比較，陽性對照組和小葉三點金提取物各劑量組小鼠腹腔毛細血管通透性均顯著增加，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）;與陽性對照組比較，小葉三點金提取物各劑量組小鼠腹腔毛細血管通透性差異無統計學意義（P>0.05），詳見表2。

3.3 小葉三點金提取物對角叉菜膠致小鼠足腫脹的影響

與空白組比較，陽性對照組和小葉三點金提取物高、中劑量組小鼠足腫脹度均顯著降低，足腫脹度抑制率顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）;與陽性對照組比較，小葉三點金提取物低劑量組小鼠足腫脹度顯著升高，足腫脹抑制率顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05），而小葉三點金高、中、低劑量組小鼠足腫脹度及腫脹抑制率差異均無統計學意義（P>0.05），詳見表3。

3.4 小葉三點金提取物對二甲苯致腎上腺摘除小鼠耳腫脹的影響

與空白組比較，陽性對照組和小葉三點金提取物高、中劑量組腎上腺摘除小鼠耳腫脹度均顯著降低，耳腫脹抑制率顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）;與陽性對照組比較，小葉三點金提取物低劑量組腎上腺摘除小鼠耳腫脹度顯著增高，耳腫脹抑制率顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05），而小葉三點金提取物高、中劑量組腎上腺摘除小鼠耳腫脹度及腫脹抑制率差異均無統計學意義（P>0.05），詳見表4。

3.5 小葉三點金提取物對角叉菜膠致腎上腺摘除小鼠足腫脹的影響

3.5.1 腫脹度 與空白組比較，陽性對照組和小葉三點金提取物高、中劑量組腎上腺摘除小鼠足腫脹度均顯著降低，足腫脹抑制率顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）;與陽性對照組比較，小葉三點金提取物低劑量組腎上腺摘除小鼠足腫脹度顯著增高，足腫脹抑制率顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05），而小葉三點金提取物高、中劑量組腎上腺摘除小鼠足腫脹度及腫脹抑制率差異均無統計學意義（P>0.05），詳見表5。

3.5.2 足趾炎性部位中MDA、SOD、NO水平 與空白組比較，陽性對照組和小葉三點金提取物高、中劑量組腎上腺摘除小鼠足趾炎性部位中MDA、NO水平均顯著降低，SOD水平均顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05）;與陽性對照組比較，小葉三點金提取物低劑量組腎上腺摘除小鼠足趾炎性部位中MDA、NO水平均顯著降低，SOD水平顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05），而小葉三點金提取物高、中劑量組腎上腺摘除小鼠足趾炎性部位中MDA、SOD、NO水平差異均無統計學意義（P>0.05），詳見表6。

4 討論

中藥以其種類繁多、成分復雜多樣、藥理作用廣泛、毒副作用少等特點成為抗炎藥物研究的首選對象。炎癥通常會改變機體的正常生理指標，誘發多種急、慢性炎癥疾病[12]，并使含血管系統的生物機體產生復制的防御反應[13-14]。目前，臨床治療抗炎藥物是僅次于抗感染藥物的第二大類藥物，除腎上腺皮質激素類與非甾體類抗炎藥物以外，還涉及部分中藥，應用較為廣泛[15]。許多清熱解毒及抗凝血化瘀中藥具有抗炎、改善血液循環功能，其在防治急慢性炎癥、腹腔感染性疾病等方面具有明顯療效[16-17]。實驗研究證實，中藥的抗炎作用機制具多途徑作用的特點，主要包括影響下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸（HPAA）系統功能、抑制花生四烯酸代謝、干擾炎癥細胞、抗血栓生成、清除氧自由基等方面，與現代藥理學炎癥機制研究相對應，其研究和開發價值越來越受到學者的重視[18-19]。

本研究采用二甲苯、醋酸、角叉菜膠等分別建立小鼠炎癥模型，并考察了不同劑量的小葉三點金提取物的抗炎作用。結果顯示，高、中劑量的小葉三點金提取物對二甲苯致正常小鼠和腎上腺摘除小鼠的耳腫脹均有明顯的抑制作用;不同劑量小葉三點金提取物對冰醋酸致正常小鼠腹腔毛細血管通透性增加均具有明顯的抑制作用;不同劑量小葉三點金提取物對角叉菜膠致正常小鼠足腫脹有明顯抑制作用，高、中劑量小葉三點金提取物對角叉菜膠致腎上腺摘除小鼠足腫脹有明顯的抑制作用。

進一步對角叉菜膠致炎模型腎上腺摘除小鼠足趾炎性部位中MDA、SOD、NO水平進行考察后發現，高、中劑量小葉三點金提取物能顯著降低小鼠炎性部位中MDA、NO水平，升高SOD水平。MDA是脂質氧化終產物，會引起蛋白質、核酸等生命大分子的交聯聚合，且具有細胞毒性;SOD是生物體內重要的抗氧化酶，具有特殊的生理活性，是生物體內清除自由基的首要物質[20];NO是一種重要的炎癥介質，能夠誘導促炎癥因子，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）等的產生[21]。本研究表明，小葉三點金提取物可通過降低大鼠足趾炎性部位中MDA、NO水平和提高SOD水平來發揮抗炎作用。

在炎癥過程中，體內的抗炎機制對于機體穩態的維持至關重要。HPAA系統是機體神經-內分泌-免疫調節網絡中一條重要的體液免疫調節通路，該系統分泌的激素不僅來源于內分泌腺，亦可來自外周淋巴細胞，其與炎癥免疫關系密切[22]。為此，本研究在正常小鼠的基礎上，還以腎上腺摘除小鼠為對象，考察了小葉三點金提取物的抗炎作用。結果顯示，小葉三點金提取物對摘除或不摘除腎上腺的小鼠均具有明顯的抗炎活性，提示其抗炎作用機制可能與HPAA系統功能無關。

綜上所述，小葉三點金提取物對二甲苯致小鼠耳腫脹、冰醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性增加、角叉菜膠致小鼠足腫脹等急性炎癥均有明顯抑制作用，顯示出良好的抗炎活性;其抗炎作用機制與降低MDA、NO水平并提高SOD水平有關，且該抗炎作用的發揮不依賴HPAA系統。

參考文獻

[ 1 ] 吳征鎰.新華本草綱要：第3冊[M].上海：上海科學技術出版社，1991：130.

[ 2 ] 吳瑤，傅本重，楊永進，等.藥用山螞蝗屬植物的化學成分和藥理活性研究進展[J].現代生物醫學進展，2016，16（26）：5191-5195.

[ 3 ] 劉小輝，華燕.小葉三點金的苯丙素類成分分析[J].西南林學院學報，2009，29（2）：92-93.

[ 4 ] 熊艷，李恒，余曉東，等.小葉三點金不同萃取相對尖吻蝮蛇毒主要酶類的抑制作用[J].重慶師范大學學報（自然科學版），2018，35（6）：105-111.

[ 5 ] 邱泉.小葉三點金的化學成分研究及其在蛇傷救治中的應用進展[J].蛇志，2013，25（2）：213-214.

[ 6 ] 劉艷娥，劉迎梅，史俊友.小葉三點金黃酮含量及其抗氧化活性測定[J].山東化工，2015，44（24）：59-60.

[ 7 ] 劉小輝，王長虹，侴桂新，等.小葉三點金的黃酮類成分研究[J].天然產物研究與開發，2010，22（6）：976-978、1008.

[ 8 ] 毛紹春，李竹英，李聰.小葉三點金化學成分研究[J].中草藥，2007，38（8）：1157-1159.

[ 9 ] GOVINDARAJAN R，VIJAYAKUMAR M，RAO CHV，et al. Antiinflammatory and antioxidant activities of Desmodium gangeticum fractions in carrageenan-induced inflamed rats[J]. Phytother Res，2007，21（10）：975-979.

[10] 唐云麗，劉君君，潘翠柳，等.赪桐根4個極性部位抗炎活性的比較[J].中成藥，2019，41（3）：663-668.

[11] 包婷雯，左明麗，王敏，等.藏藥麻花秦艽不同部位醇提物的抗炎作用研究[J].中國藥房，2018，29（22）：3114-3118.

[12] 姚茹，張銳虎，王璐，等.蓮心堿對佛波酯所致耳腫脹炎癥模型小鼠的抗炎作用及機制研究[J].中國藥房，2018，29（17）：2364-2368.

[13] 孫士平，張成玉，李和平，等. γ-氨基丁酸對LPS介導的機體炎性反應影響的研究進展[J].中國畜牧獸醫，2018，45（8）：2128-2134.

[14] 閆安，謝云亮.當歸多糖對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織氧化應激水平及炎癥因子表達的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2018，24（2）：123-127.

[15] 張鵬，楊彩霞，張澤輝，等.中藥抗炎作用及機制研究概況[J].動物醫學進展，2016，37（8）：108-111.

[16] 周悅芳，范培紅.中藥免疫調節作用研究進展[J].時珍國醫國藥，2017，28（1）：204-207.

[17] 劉強，牟洪波，劉元祿.中藥車前子對小鼠氣囊滑膜炎細胞因子TNF-α及IL-12影響的實驗研究[J].中華中醫藥學刊，2007（4）：816-818.

[18] 黃濱，雷小勇.中藥抗炎作用發揮途徑及作用機制研究進展[J].臨床合理用藥雜志，2015，8（33）：177-179.

[19] 曹志方.牛大力多糖和總黃酮抗炎作用及機制的研究[D].海口：海南大學，2016.

[20] 劉洋.不同運動訓練強度對小鼠血清MDA含量和SOD活性的影響[J].黑龍江畜牧獸醫，2016（12上）：231-233.

[21] 張芳，沈紹清，楊衛麗.二烯丙基三硫醚對脂多糖誘導小鼠肺炎的改善作用[J].現代藥物與臨床，2019，34（6）：1610-1614.

[22] 韓鶴，戴澤平.生物鐘系統與下丘腦-垂體-腎上腺軸相互作用的研究進展[J].醫學綜述，2015，21（12）：2123-2126.

（收稿日期：2019-03-30 修回日期：2019-08-08）

（編輯：段思怡）