烏頭湯治療骨關節炎作用機制的網絡藥理學研究

駱帝 梁學振 劉金豹 許波 李剛

摘 要 目的：研究烏頭湯治療骨關節炎的作用機制，為骨關節炎的治療提供新的方向與靶點。方法：以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為指標，借助中藥系統藥理學數據庫及分析平臺（TCMSP）篩選烏頭湯中川烏、麻黃、黃芪、白芍與甘草的活性成分;通過檢索治療靶點數據庫（TTD）等數據庫和挖掘基因表達數據庫（GEO）中的芯片數據獲取骨關節炎的作用靶點;利用生物學信息注釋數據庫（DAVID）對靶點基因進行基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。結果：從烏頭湯中共篩選出活性成分30個，包括槲皮素、丁子香萜、梔子醇等，與骨關節炎相關的作用靶點31個，包括β2腎上腺素能受體、花生四烯酸5-脂氧合酶、雄激素受體等。烏頭湯治療骨關節炎的生物過程與白細胞介素1受體信號轉導、過氧化物酶增殖激活受體的協同激活作用、酪氨酸激酶受體2的信號轉導作用等有關。烏頭湯主要通過調節腫瘤壞死因子信號通路、血管內皮生長因子信號通路、破骨細胞分化信號通路、核轉錄因子κB信號通路、Toll樣受體信號通路等發揮治療骨關節炎的作用。結論：本研究采用網絡藥理學分析了烏頭湯治療骨關節炎的潛在作用機制，可為進一步研究烏頭湯治療骨關節炎的藥效物質基礎及作用靶點提供參考。

關鍵詞 骨關節炎;烏頭湯;網絡藥理學;作用機制;中藥系統藥理學數據庫及分析平臺

ABSTRACT? ?OBECTIVE： To study the mechanism of Wutou decoction in the treatment of osteoarthritis， and to provide a new direction and target for the treatment of osteoarthritis. METHODS： Using oral bioavailability （OB）≥30%， drug like （DL）≥0.18% as index， active components were screened from Wutou decoction by using TCM systematic pharmacological analysis platform （TCMSP）， such as Aconitum carmichaelii， Ephedra sinica， Astragalus propinquus， Paeonia tactilora， Glycyrrhiza uralensis. Targets of osteoarthritis were obtained by retrieving therapeutic targets database （TTD） and mining thip data from gene expression database （GEO）. Target genes were analyzed by GO and KEGG pathway enrichment analysis were performed by using DAVID database. RESULTS： A total of 30 active components were screened， including quercetin， terpenoids and gardenol; 31 targets related to osteoarthritis were obtained， including β2 adrenergic receptor， arachidonate 5-lipoxygenase and androgen receptor. The biological process of Wutou decoction in treatment of osteoarthritis was mainly related to the IL-1 receptor signal transduction， synergistic activation of peroxidase proliferation activated receptor， signal transduction of tyrosine kinase receptor 2. It mainly regulated tumor necrosis factor signaling pathway， vascular endothelial growth factor signaling pathway， osteoclasts differentiation signaling pathway， nuclear factor κB signaling pathway， Toll-like receptor signaling pathway so as to play a role in the treatment of osteoarthritis. CONCLUSIONS： The study analysis the potential mechanism of Wutou decoction in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology， which can provide reference for further study on the material basis and target of Wutou decoction in the treatment of osteoarthritis.

KEYWORDS? ?Osteoarthritis; Wutou decoction; Network pharmacology; Mechanism; TCMSP

骨關節炎是臨床常見難治疾病，屬于祖國醫學“骨痹”范疇，其發病以在全身與局部綜合因素下導致的軟骨基質崩解，軟骨細胞數量降低，伴有關節周圍骨質增生為特點[1]，確切病因與發病機制尚未明確。現代醫學臨床主要治療手段為非藥物治療、藥物治療與外科治療，但是非藥物治療效果并不確切;鎮痛藥、非甾體抗炎藥、糖皮質激素等長期服用存在如消化道出血、心血管風險等副作用;而外科手術治療又存在費用高等問題[2]。因此，亟待探索新的安全替代治療方案。

傳統中醫藥歷史悠久，經過長期的經驗積累與臨床實踐檢驗，具有療效確切、安全穩定與接受度高等諸多優勢，逐漸成為許多疑難疾病臨床治療與新藥開發的研究熱點[3-4]。烏頭湯出自醫圣張仲景所著《金匱要略》，原文載述“病歷節不可屈伸疼痛，烏頭湯主之”。全方由麻黃、白芍、黃芪、甘草、制川烏5味中藥組成，具有溫經通絡、除濕止痛的功效，被歷代醫家廣泛用于骨關節炎的治療[5]，筆者將其應用于臨床也取得了令人滿意的療效。但因中藥復方成分眾多，作用多通路與多靶點關系網復雜，現有檢測技術手段普遍存在花費高昂、靈敏度低、尚無行業統一標準規范等問題，故無法精準、可靠地揭示中藥復方作用機制[6-7]。

得益于生物信息學、計算機、網絡與大數據技術的發展，網絡藥理學作為一門研究藥物的新學科得以創立，尤其是在整體性與系統性的特點與中醫藥不謀而合[8]，為中藥方劑潛在活性成分與作用靶點的進一步研究開辟了新道路。基于此，本研究基于網絡藥理學，通過數據挖掘與分析，篩選和系統預測烏頭湯活性成分治療骨關節炎的潛在作用靶點和信號通路，以期為骨關節炎的治療提供新的方向與靶點。

1 材料與方法

1.1 數據庫、軟件及分析平臺

本研究使用的數據庫、軟件及相關分析平臺見表1。

9 疾病基因數據庫（DisGeNET） http：//www.disgenet.org/web/DisGeNET/ 更新于2019.05 10 人類表型本體論（HPO） https：//hpo.jax.org/app/ 1.5.0 11 Cytoscape https：//cytoscape.org/ 3.2.1 12 R語言 https：//www.r-project.org/ 3.6.0 13 生物學信息注釋數據庫（DAVID） https：//david.ncifcrf.gov/ 6.8 14 蛋白質相互作用數據庫（STRING） https：//string-db.org/ 11.0 ]

1.2 烏頭湯中5味中藥的活性成分收集與篩選

中藥在口服后進入人體消化道后，要經過吸收、分布、代謝與排泄生理過程，即藥動學特性（ADME）[9-10]。在TCMSP中檢索烏頭湯中5味中藥的相關化學成分的ADME參數，利用藥物重要的定性指標口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）與類藥性（Drug like，DL）進行初步篩選，以獲得5味中藥的活性成分，篩選標準為OB≥30%，DL≥0.18[11-12]。

1.3 烏頭湯作用靶點的預測與活性成分-靶點網絡圖的構建

通過TCMSP靶點預測模型預測烏頭湯中5味中藥活性成分的作用靶點，采用生物網絡可視化和分析軟件Cytoscape 3.2.1分別繪制5味中藥的活性成分與作用靶點的網絡圖和烏頭湯活性成分-靶點網絡圖，其中用“節點（Node）”分別表示中藥、活性成分與靶點，用“邊（Edge）”表示中藥、活性成分與靶點的相互作用關系[13]，靶點對應的成分越多，其度值也就越大，提示該靶點的重要性可能相對越高。

1.4 篩選骨關節炎的作用靶點

以“Osteoarthritis”為關鍵詞，通過篩選TTD、DrugBank、OMIM、GAD、PharmGKB、DisGeNET與HPO 7個數據庫獲得骨關節炎的相關靶點。

在GEO數據庫樣本中以“Osteoarthritis”為關鍵詞檢索相關芯片，獲取編號為GSE43923的芯片數據原始文件和GPL570的芯片基因注釋文件，該芯片數據中包含了6個關節軟骨樣本，其中3名來自骨關節炎患者，健康對照3名。使用R語言對芯片的原始數據加以分析，采用多陣列平均分析（Robust multiarray average，RMA）算法進行背景校正和矩陣數據歸一化處理，利用Limma程序包分析芯片數據的差異基因，將顯著差異基因的篩選條件設定為P<0.05，差異倍數（Fold change，FC）>2;運用Plot程序包繪制芯片原始的火山圖。最終獲得骨關節炎的差異表達基因。

最后，將7個數據庫獲得的骨關節炎靶點與R語言分析芯片獲得的差異表達基因取并集，即獲得已明確的骨關節炎的相關靶點。

1.5 DAVID富集分析

將“1.3”項下獲得的烏頭湯治療骨關節炎的相關靶點與“1.4”項下獲得的骨關節炎疾病的相關靶點取交集，即可得到烏頭湯治療骨關節炎的關鍵靶點。

DAVID數據庫是一個具有全面功能注釋、可視化和集成發現的數據庫工具，可完成基因表達數據的批量處理與注釋、基因本體論（Gene ontology，GO）及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。利用DAVID在線分析工具對上述關鍵靶點進行功能富集分析，運用R語言ggPlot 2程序包繪制氣泡圖，圖中氣泡越大則代表信號通路的基因數目越多，與該通路的重要性成正比。

1.6 構建關鍵靶點的蛋白質-蛋白質相互關系

STRING數據庫是一款在線檢索相互作用基因與蛋白的網絡數據庫。將“1.5”項下獲取的關鍵靶點輸入搜索欄，并對結果進行整合，借助軟件Cytoscape 3.2.1構建烏頭湯治療骨關節炎關鍵靶點蛋白互作（Protein-protein interaction，PPI）網絡圖。

2 結果

2.1 烏頭湯中5味中藥的活性成分收集

通過TCMSP數據庫共獲得烏頭湯中川烏、麻黃、黃芪、白芍、甘草5味中藥的相關成分642個，其中滿足OB≥30%的成分共有224個，滿足DL≥0.18的成分共有169個。根據ADME參數篩選標準，同時滿足OB≥30%與DL≥0.18的成分共有122個。

2.2 烏頭湯作用靶點的預測與活性成分-靶點網絡圖的構建

利用Cytoscape 3.2.1軟件分別構建了5味中藥的活性成分與作用靶點的網絡圖，見圖1。經TCMSP數據庫靶點預測模型配對分析后得到有對應靶點的活性成分共30個，詳見表2;再利用Cytoscape 3.2.1軟件構建烏頭湯活性成分-靶點網絡圖，其中烏頭湯活性成分與作用靶點存在708個相互關系，烏頭湯治療骨關節炎相關作用靶點138個，烏頭湯活性成分-靶點網絡圖見圖2。

2.3 骨關節炎的作用靶點

通過TTD等7個數據庫分別獲得骨關節炎疾病相關靶點35、1、61、97、2、80、33個，取并集并刪除重復項后獲得骨關節炎疾病靶點227個。

芯片GSE43923的原始數據文件中包含了6個關節軟骨樣本，將3名骨關節炎患者的骨贅軟骨組織與3名健康人的軟骨組織進行對比。借助R語言分析共獲得331個顯著改變與影響的基因（刪除重復項后為307個），其中上調基因數為256個，下調基因數為75個，繪制骨關節炎差異基因的火山圖，詳見圖3。

將7個數據庫獲得的骨關節炎靶點與R語言分析芯片獲得的差異表達基因取并集，再與烏頭湯中5味中藥活性成分的作用靶點取交集，即獲得已明確的烏頭湯治療骨關節炎的關鍵靶點31個，詳見表3。

2.4 DAVID富集分析

采用DAVID在線數據進行GO和KEGG通路分析，將獲得的前10位GO生物過程與KEGG通路按P值升序排列，并以氣泡圖的形式展現出來。結果，烏頭湯治療骨關節炎的GO生物過程見圖4，烏頭湯治療骨關節炎的KEGG通路見圖5。

由圖4可知，烏頭湯治療骨關節炎的GO進程主要有白細胞介素1受體的信號轉導、過氧化物酶增殖激活受體的協同激活作用、ERBB2在腫瘤細胞中的轉導作用、核轉錄因子κB（NF-κB）的激活作用、巨噬細胞刺激蛋白受體的信號通路等。

由圖5可知，烏頭湯治療骨關節炎的KEGG通路主要有腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、血管內皮生長因子信號通路、破骨細胞分化信號通路、NF-κB信號通路、Toll樣受體信號通路、甲狀腺激素信號通路、磷酯酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信號通路、缺氧誘導因子1（HIF-1）信號通路、促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路及雌激素信號通路。

2.5 構建關鍵靶點PPI網絡圖

烏頭湯治療骨關節炎關鍵靶點PPI網絡圖見圖6。

由圖6可知，31個關鍵靶點之間相互作用關系數為40個;共挖掘出214個靶點與關鍵靶點存在直接或者間接關系。運用Cytoscape 3.2.1軟件中Network Analyzer插件工具對每個節點進行相關網絡參數分析，其中度值的大小與其重要程度呈正相關，故圖中節點顏色越深則代表其重要程度越大。

3 討論

骨關節炎是導致中老年人喪失運動能力的常見疾病，給患者身心與經濟帶來沉重負擔，在全球老齡化的大趨勢下，其發病率逐年增加[14]。目前，骨關節炎尚缺乏有效直接的治愈手段，但可以通過有針對性的個性化診療方案以達到緩解疼痛、改善運動功能、延緩疾病進展、提高生活質量的目的。中醫學一般將骨關節炎歸于“骨痹”范疇，其基本病機為本虛標實，多因機體精血不足、陽虛血瘀，風寒濕外邪趁虛而入，導致筋脈痹阻、氣血凝澀、骨骼失養、日久成痹[15-16]。烏頭湯由東漢名醫張仲景創制，為歷代所推崇治療骨關節炎的代表方劑。本研究初步篩選出烏頭湯中的槲皮素、谷甾醇、丁子香萜、（+）-兒茶酚、芍藥苷元等30個活性成分，最終挖掘出烏頭湯治療骨關節炎的31個關鍵靶點并繪制出與之關聯的214個靶點和1 172個相互關系的復雜網絡圖，證明了中藥方劑中的有效成分與其作用的靶點之間不僅存在密切的協同關系，而且從側面反映出中醫藥治療疾病具有多成分、多靶點、多路徑的特色，這與中醫整體觀念與辨證施治思想不謀而合。

從DAVID對31個關鍵靶點富集分析結果可知，烏頭湯主要通過干預細胞周期、炎癥與內分泌等相關通路而發揮治療骨關節炎的作用。（1）在細胞周期相關通路方面：①研究證實[17-18]，血管內皮生長因子在活動性關節炎中存在高表達現象，進而促進血管內皮增生，為炎癥因子的聚攏提供條件，與骨關節炎的炎癥密切相關;②破骨細胞在局部炎性因子與細胞因子的刺激下，其活性升高，大量增殖、分化與成熟，骨代謝平衡被打破，軟骨下骨重塑增加導致骨關節炎進展[19-20];③NF-κB信號通路被激活后，可誘導滑膜細胞生成大量細胞因子、趨化因子與基質金屬蛋白酶，導致關節軟骨分解加劇[21-22]。④PI3K-Akt信號通路已被證實是參與抗軟骨凋亡的重要路徑，其中Akt在該通路中承擔核心作用，而PI3K僅發揮傳輸信號的媒介作用[23-24]。⑤HIF-1已被研究證明在細胞缺氧狀態下廣泛參與能量代謝、血管生成、pH調控與細胞周期等生理進程，并且還對涉及軟骨組織的疾病有重要調控作用[25-26]。⑥軟骨細胞作為能合成軟骨基質的唯一細胞，一旦病變釋放出的炎癥因子激活MAPK信號通路，最終可引發基質金屬蛋白酶升高、軟骨細胞凋亡與軟骨破壞等病理反應[27-28]。（2）在炎癥相關通路方面：①TNF-α在骨關節炎軟骨蛻變中激活多種參與軟骨基質降解的酶，此外TNF-α可誘導白細胞介素的產生，而反之又可促進TNF-α的活性，從而加速軟骨破壞[29-30]。②在骨關節炎早期Toll樣受體表達即偏高并伴隨關節腫痛與關節積液等癥狀，此外還有研究證實其可在滑膜細胞與關節軟骨中均可被檢測到[31]。（3）在內分泌相關通路方面：①甲狀腺激素在人體發育過程中，無論是整個童年和成人階段，幾乎在所有組織中都發揮廣泛和復雜的作用。有研究確認了甲狀腺激素代謝在關節軟骨維持和骨關節炎發病中的作用[32]。②已有研究證實雌激素可以直接作用于骨骼、肌肉與滑膜組織的炎癥反應上，雌激素受體更是在關節軟骨與骨細胞中廣泛表達[33]。

綜上所述，本研究通過綜合運用生物信息學與網絡藥理學的手段，探討烏頭湯治療骨關節炎可能的關鍵基因及分子機制，可為治療骨關節炎提供新的切入點，為深入挖掘其潛在的機制提供參考。不可否認的是本研究尚存在一些局限性，但同時，其也為今后中藥方劑關鍵作用機制的研究和新藥的研發提供了新方法、新路徑與新方向。

參考文獻

[ 1 ] SARZIPUTTINI P，CIMMINO MA，SCARPA R，et al. Osteoarthritis：an overview of the disease and its treatment strategies[J]. Semin Arthritis Rheum，2005，35（1）：1-10.

[ 2 ] SHEN J，CHEN D. Recent progress in osteoarthritis research[J]. J Am Acad Orthop Surg，2014，22（7）：467-468.

[ 3 ] SCHENONE M，DAN?íK V，WAGNER BK，et al. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery[J]. Nat Chem Biol，2013，9（4）：232-240.

[ 4 ] SHEN B. A new golden age of natural products drug dis- covery[J]. Cell，2015，163（6）：1297-1300.

[ 5 ] 梅陽陽，付長龍，龐書勤，等.烏頭湯藥理藥效研究及其干預骨關節炎的機制探討[J].風濕病與關節炎，2016，5（6）：47-50.

[ 6 ] 俞仲毅，余國姍.中藥現代技術研究的緣起與流行及反思[J].上海中醫藥大學學報，2018，32（3）：1-8.

[ 7 ] 劉昌孝.對中藥現代化及中藥國際化發展的思考[J].中國藥房，2016，27（11）：1441-1444.

[ 8 ] 張彥瓊，李梢.網絡藥理學與中醫藥現代研究的若干進展[J].中國藥理學與毒理學雜志，2015，29（6）：883-892.

[ 9 ] XU X，ZHANG W，HUANG C，et al. A novel chemometric method for the prediction of human oral bioavailability[J]. Int J Mol Sci，2012，13（6）：6964-6982.

[10] LIU H，WANG J，ZHOU W，et al. Systems approaches and polypharmacology for drug discovery from herbal medicines：an example using licorice[J]. J Ethnopharmacol，2013，146（3）：773-793.

[11] RU J，PENG L，WANG J，et al. TCMSP：a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines[J]. J Cheminform，2014，6（1）：6-13.

[12] WANG S，WANG H，LU Y. Tianfoshen oral liquid：a CFDA approved clinical traditional Chinese medicine，normalizes major cellular pathways disordered during colorectal carcinogenesis[J]. Oncotarget，2017，8（9）：14549-14569.

[13] LI J，PENG Z，LI Y，et al. Systems pharmacology-based dissection of mechanisms of Chinese medicinal formula Bufei Yishen as an effective treatment for chronic obstructive pulmonary disease[J]. Sci Rep，2015.DOI：10.1073/pnas.0530291100.

[14] SHANNON P，MARKIEL A，OZIER O，et al. Cytoscape：a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks[J]. Genome Res，2003，13（11）：2498-2504.

[15] ZHAI Y，GAO GD，XU SY. Basic research progress of knee osteoarthritis[J]. Zhongguo Gu Shang，2012，25（1）：83-87.

[16] 陳達，陳后煌，邵翔，等.烏頭湯抑制骨關節炎炎癥反應的作用機制探討[J].風濕病與關節炎，2016，5（8）：62-66.

[17] YUAN Q，SUN L，LI JJ，et al. Elevated VEGF levels contribute to the pathogenesis of osteoarthritis[J]. BMC Musculoskelet Disord，2014，15（1）：1-8.

[18] HAMILTON JL，NAGAO M，LEVINE BR，et al. Targeting VEGF and its receptors for the treatment of osteoarthritis and associated pain[J]. J Bone Miner Res，2016，31（5）：911-924.

[19] GEURTS J，PATEL A，HIRSCHMANN MT，et al. Elevated marrow inflammatory cells and osteoclasts in subchondral osteosclerosis in human knee osteoarthritis[J]. J Orthop Res，2016，34（2）：262-269.

[20] MARIANNE D，KOMAROVA SV，AJAY B，et al. Monocytes from patients with osteoarthritis display increased osteoclastogenesis and bone resorption：the in vitro osteoclast differentiation in arthritis study[J]. Arthritis Rheum，2014，65（1）：148-158.

[21] HASEEB A，HAQQI TM. Immunopathogenesis of osteoarthritis[J]. Clin Immunol，2013，146（3）：185-196.

[22] WU L，HUANG X，LI L，et al. Insights on biology and pathology of HIF-1α/-2α，TGF-β/BMP，Wnt/β-catenin，and NF-κB pathways in osteoarthritis[J]. Curr Pharm Des，2012，18（22）：3293-3312.

[23] WANG C，ZENG L，ZHANG T，et al. Tenuigenin prevents IL-1β-induced inflammation in human osteoarthritis chondrocytes by suppressing PI3K/Akt/NF-κB signaling pathway[J]. Inflammation，2016，39（2）：807-812.

[24] CHEN J，CRAWFORD R，XIAO Y. Vertical inhibition of the PI3K/Akt/mTOR pathway for the treatment of osteoarthritis[J]. J Cell Biochem，2013，114（2）：245-249.

[25] FERNáNDEZTORRES J，MARTíNEZNAVA GA，GóM- EZQUIROZ L E，et al. Role of HIF-1α signaling pathway in osteoarthritis：a systematic review[J]. Rev Bras Reumatol Engl Ed，2016，57（2）：162-173.

[26] ZHANG FJ，LUO W，LEI GH. Role of HIF-1α and HIF-? ?2α in osteoarthritis[J]. Joint Bone Spine，2015，82（3）：144-147.

[27] WANG D，QIAO J，ZHAO X，et al. Thymoquinone inhibits IL-1β-induced inflammation in human osteoarthritis chondrocytes by suppressing NF-κB and MAPKs signaling pathway[J]. Inflammation，2015，38（6）：2235-2241.

[28] GAO SC，YIN HB，LIU H X，et al. Research progress on MAPK signal pathway in the pathogenesis of osteoarthritis[J]. Zhongguo Gu Shang，2014，27（5）：441-444.

[29] STANNUS O，JONES G，CICUTTINI F，et al. Circulating levels of IL-6 and TNF-α are associated with knee radiographic osteoarthritis and knee cartilage loss in older adults[J]. Osteoarthritis Cartilage，2010，18（11）：1441- 1447.

[30] HUANG J，ZHUO LS，WANG YY，et al. Effects of electroacupuncture on synovia IL-1beta and TNF-alpha contents in the? rabbit with knee osteoarthritis[J]. Zhen Ci Yan Jiu，2007，32（2）：115-118.

[31] ANJALI N，VEERO K，CHARLES BJ，et al. Synovial fluid from patients with early osteoarthritis modulates fibroblast-like synoviocyte responses to toll-like receptor 4 and toll-like receptor 2 ligands via soluble CD14[J]. Arthritis & Rheumatism，2014，64（7）：2268-2277.

[32] WILLIAMS GR. Thyroid hormone actions in cartilage and bone[J]. Eur Thyroid J，2013，2（1）：3-13.

[33] RICHETTE P，CORVOL M，BARDIN T. Estrogens，cartilage，and osteoarthritis[J]. Joint Bone Spine，2003，70（4）：257-262.

（收稿日期：2019-03-21 修回日期：2019-05-27）

（編輯：唐曉蓮）