外泌體MicroRNA-301在胃癌患者血清中的表達及臨床意義

黃琳

[摘要]目的：探討血液中外泌體miRNA-301在胃癌患者血清中的表達及臨床意義。方法：選擇我院行胃癌手術及隨訪資料完整的胃癌患者（70例）和健康對照者（70例）為研究對象，抽取未行任何治療的靜脈血，提取血清外泌體，以及外泌體總RNA，并檢測胃癌和健康對照者外泌體中的miR-301表達水平。分析胃癌和健康對照者血清外泌體中miR-301表達差異及血清外泌體中miR-301表達水平與胃癌臨床病理參數的關系。結果：胃癌患者血清外泌體中miR-301的表達水平為（7.17±0.98）fmol/L，顯著高于健康對照者[（0.93±0.61）fmol/L，P<0.01]，同時外泌體miR-301的受試者工作特征曲線顯示，血清外泌體miR-301對胃癌診斷具有良好的特異度和敏感度（曲線下面積0.948）;進一步分析發現：外泌體miR-301與胃癌患者的性別、年齡、分化程度等無相關性（P>0.05），而與患者腫瘤大小、TNM分期及Hp感染狀態明顯相關（P<0.05）。結論：血清外泌體miR-301的檢測可能有助于胃癌的診斷。

[關鍵詞]MicroRNA，胃癌，敏感度，特異性，腫瘤標志物

[中圖分類號]R735.2[文獻標識碼]A [文章編號]2096-5249（2019）22-0018-02

胃癌是全球范圍內發病率最高的腫瘤之一，而我國是胃癌的高發區，年患病率和死亡率均是世界平均水平的2倍多。近30%患者在初診時已是晚期，40%局灶腫瘤患者在術后出現復發與轉移，10%-20%晚期胃癌患者對化療藥物如順鉑耐藥，且其他患者在化療6-15個月逐漸產生耐藥，從而導致腫瘤進展，預后極差。為了提高胃癌患者的生存質量，改善胃癌患者的預后，我們應尋找胃癌早期診斷的途徑。目前的研究熱點為無創檢測的血清學標志物，這些血清學標志物可作為胃癌的生物學標志物。CA-199、CEA等腫瘤標志物是目前臨床較常應用于診斷胃癌的血清學標志物，但其敏感度和特異性較低，所以需要尋找一種或幾種敏感度和特異性較高的胃癌血清標志物提高胃癌的早期診斷以及改善胃癌患者的預后情況。

1材料與方法

1.1入組患者信息 我們收集了70例2016年1月-2018年12月在我院住院的胃癌患者的血清標本，這些患者均行術后病理并經病理證實為胃癌。這些患者均未接受任何腫瘤相關的治療。70例患者中，男性為41例，女性為29例;患者年齡37～82歲，平均年齡為（59.11±14.77）歲;按2010年國際抗癌聯盟（UICC）TNM標準分期，這70例胃癌患者可分為：I/Ⅱ期：43例，Ⅲ/Ⅳ期：27例;高、中分化腫瘤：47例，低分化腫瘤：23例。幽門螺桿菌陽性41例，陰性29例。70例健康對照組的血清標本均來源于本院的健康體檢者。該臨床試驗已通過南通大學附屬醫院倫理委員會的批準，所有血清標本均獲知情同意書。

1.2研究方法（1）收集標本：將患者5mL靜脈外周血收集于采血管中并標記患者基本信息，24h內離心，收集上層血清，并儲存至-80℃冰箱保存。提取外泌體時，解凍血清，并通過3000r/min，15min離心處理，去除沉淀和脂質層，再在13000r/min，2min離心去除紅細胞等殘留的細胞物質，留取沉淀，即外泌體。（2）外泌體中的miRNA的提取：按QIAZOL試劑盒步驟進行外泌體miRNA的提取。（3）miRNA的逆轉錄及定量檢測：參照美國TaqMan逆轉錄試劑盒行逆轉錄，逆轉錄反應條件為16℃30min，42℃30min，85℃10min。（4）熒光定量PCR檢測外泌體miRNA表達量：PCR反應體系為nuclease-free water 8pL，2x miR-A PCR Mix IOpL，cDNA模板為2uL。根據PCR上機數據獲得GAPDH的CT值作為質控參數，PCR的反應條件為95℃預變性5分鐘;95℃變性15S，60℃退火60S，一共為40個循環。以U6作為內參，采用2法計算外泌體中miR-301的表達量，結果以倍數來表示。

1.3統計方法分析所得數據采用SPSS25.0軟件。比較外泌體miR-301在胃癌和健康對照者血清中的差異表達時使用配對樣本的t檢驗分析，比較血清外泌體miR-301表達水平與胃癌的臨床病理參數間關系時用兩獨立樣本的t檢驗或單因素方差分析的方法，血清外泌體miRNA-301作為胃癌診斷分子標記的敏感度和特異度用ROC曲線的曲線下面積計算，當P<0.05時表明差異具有統計學意義。

2 實驗結果

2.1外泌體miR-301表達水平在胃癌和健康對照組血清中的比較通過RT-PCR檢測70例胃癌患者和健康對照組血清外泌體miR-301的表達水平差異。研究結果表明，健康對照組中外泌體miR-301表達水平為（0.91±1.09）fmol/L，而胃癌組外泌體miR-301表達水平為（6.71±1.08）fmol/L，差別具有統計學意義（P<0.01）

2.2血清外泌體miR-301表達水平與胃癌臨床病理參數的關系通過RT-PCR分析，我們發現，有淋巴結轉移或者病理分化程度較低的患者，血清外泌體的miR-301的表達水平較對照組稍高，但差異無統計學意義（P>0.05）。外泌體中miR-301的表達水平與胃癌患者的性別、年齡、分化程度等無相關性（P>0.05），而外泌體中miR-301的表達水平與患者腫瘤大小、TNM分期及幽門螺桿菌感染狀態呈明顯相關性且差別具有統計學意義（P<0.05，表1）。

2.3血清外泌體中CEA、CA-199、miR-30l診斷胃癌可靠性的分析通過SPSS分析ROC曲線提示：血清中CEA、CA-199、miR-301診斷胃癌的曲線下面積（AUC）結果分別為CEA 0.712、CA1990.614、miR-3010.948。診斷胃癌的最佳外泌體miR-301濃度截斷值為0.58fmol/L，其靈敏度和特異性分別為95%、97.5%（圖1，表2）。

4討論

外泌體是指包含了miRNA、lncRNA、circRNA、脂質和蛋白質的雙層膜性小囊泡（直徑在30～150nm之間），外泌體可保護其中的RNA免受酶的降解。外泌體可參與細胞活動，如腫瘤轉移、免疫調控、疾病發生發展等，故外泌體有望成為多種疾病的早期診斷標志物。

近幾年研究發現，miRNA可在外周血的外泌體中穩定存在，且最新研究結果表明外周絕大多數miRNA來源于外泌體，外泌體可保護循環miRNA，使其免受RNA酶降解，故目前將外周血中外泌體源性miRNAs作為一種新型胃癌標志物。研究表明胃癌患者血清外泌體中miR-451、miR-221和miR-1較對照組呈高表達，且miR-221的表達與胃癌TNM分期相關，外泌體中miR-221的表達越高，腫瘤惡性程度越高。而前期研究表明，在胃癌組織中miR-301表達較對照組明顯增高，故本研究選擇miR-301作為外泌體標志物進行早期診斷胃癌。我們此次研究結果表明，胃癌患者血清外泌體miRNA-301的表達較健康對照組明顯升高，其表達升高的程度與胃癌的分期、腫瘤大小和幽門螺桿菌感染密切相關。ROC曲線分析指出，診斷胃癌的最佳外泌體miR-301濃度截斷值為0.56fmol/L，其靈敏度和特異度分別為95%與92.5%，曲線下面積0.948，提示對于胃癌而言，血清外泌體miR-301具有良好的診斷價值。

血清外泌體miRNA-301與胃癌的分期、轉移密切相關，有望成為胃癌治療的新靶點，尤其是外泌體可作為內源性納米級生物膜結構，順利通過血腦屏障并避免毒性和機體的免疫排斥，同時也能較好保證內容物完整性以及生物活性。這些優勢有效提升了外泌體miRNA應用于腫瘤生物靶向治療的可行性。另外，外泌體miRNA可通過液體活檢檢測出，具有敏感性高，創傷小等優勢。但目前外泌體miRNAs與胃癌研究仍處于初級階段，很多功能尚未被發現，如外泌體miRNA對免疫系統的作用等，隨著進一步的研究深入，外周血外泌體miR-301的檢測有望成為診斷胃癌及評價預后的重要指標。