過氧化氫干化學檢測方法的實驗研究

劉傳志 宮平 侯玥

摘 要：目的：采用次血紅素六肽（DhHP-6）催化H2O2氧化4-氨基安替吡啉-氯代苯酚顯色體系，建立了以反射光檢測為原理的H2O2干化學測定方法。方法：實驗采用TiO2和聚乳酸微球為試劑載體，通過試劑分層包埋制備H2O2干化學檢測片，考察了方法的反應線性、精密度和準確度及與國標方法的相關性。結果：H2O2干化學測定方法響應的線性范圍為2.0～20mg/L;H2O2濃度3.9mg/L和15.5mg/L的變異系數（CV）和加標回收率分別在3.2%～3.5%和98.2%～102.2%;與國家標準方法比較相關系數r=0.998 5;13例樣品中的H2O2濃度在1.05～18.26mg/L;與國標方法之間的兩組數據經統計差異不顯著（P>0.05）。結論：該方法快速、準確、靈敏，適合測定食品中過氧化氫的殘留。

關鍵詞：過氧化氫;次血紅素六肽;模擬酶;干化學

中圖分類號：R446.1 文獻標識碼：A 文章編號：1003-5168（2019）17-0124-04

Abstract： Objective To catalyze the oxidation of 4-aminoantipyrine-chlorophenol by H2O2 with subhemoglobin hexapeptide （DhHP-6）， and establish a dry chemical method for H2O2 determination based on the principle of reflected light detection. Methods TiO2 and polylactic acid polymer microspheres were used as reagent carriers to prepare H2O2 dry chemical detection tablets by layered entrapment. The linearity， precision and accuracy of the method and the correlation with the national standard method were investigated. Results The linear range of response of H2O2 dry chemical assay was 2.0～20mg/L; the coefficient of variation （CV） and spiked recoveries of H2O2 concentrations of 3.9mg/L and 15.5mg/L were 3.2%～3.5% and 98.2%～102.2%， respectively. The correlation coefficient with the national standard method was r=0.9985; the concentration of H2O2 in 13 samples was between 1.05 and 18.26mg/L; the statistical difference between the two groups was not significant （P>0.05）. Conclusion This method is fast， accurate and sensitive， and is suitable for the determination of residual hydrogen peroxide in food.

Keywords： Hydrogen peroxide;Deuterohemin-Ala His Thr Val Glu Lys;mimetic enzyme;dry chemistry

1 研究背景

過氧化氫（H2O2）作為強氧化物，在食品工業、制藥工業等領域具有廣泛的應用[1，2]。因此，快速、簡便和準確檢測H2O2的濃度十分重要。目前，常用的檢測H2O2的方法有比色法、滴定法、化學發光和電化學檢測[3，4]等。這些方法均需要較大型的儀器及在實驗室內進行測量，不適合進行現場即時檢驗。其中，基于酶的比色分析方法具有成本低、選擇性高、操作簡單、靈敏度高等特點。然而，酶的保質期短、易變性，加之其對操作環境變化的敏感性，使其應用受到了限制[5]。

因此，課題組在傳統比色分析的基礎之上，根據次血紅素六肽（DhHP-6）具有過氧化氫酶的催化特性[6]，建立了一種快速檢測H2O2的干化學方法，使其能實現現場實時檢測H2O2的功能，并與國家標準《食品中過氧化氫殘留量的測定》（GB 5009.226—2016）[7]使用的鈦鹽比色法進行比對分析。實驗顯示，該方法具有操作簡單、快速、準確的特點。

2 過氧化氫檢測卡的材料及制作

2.1 反應原理

H2O2在DhHP-6的催化下產生氧自由基（O-），O-通過氧化4-AAP-氯代苯酚體系顯色。

2H2O2+4-AAP-氯代苯酚 ? DhHP-6[→]4H2O+亞醌胺（紅色）

反應后顯色濃度與H2O2含量成正比，可通過漫反射光電比色進行定量分析[8]。

2.2 材料

二氧化鈦（TiO2）;聚乳酸高分子微球;DhHP-6;4-AAP-氯代苯酚;聚酯膠片;磷酸鹽緩沖液;聚乙烯醇水溶性粘合劑;表面活化劑;高壓噴槍。

2.3 制作方法

第一，按比例將聚乳酸高分子微球、DhHP-6、4-AAP-氯代苯酚、磷酸鹽緩沖液、表面活化劑和水溶性粘合劑按重量比16∶0.015∶0.085∶0.3∶0.05∶0.5進行混合，使用高壓噴槍將此混合物均勻地噴涂在聚酯膠片上，使之形成具有一定厚度、可容納一定體積液體的試劑層，所有的化學反應和顯色均在此完成。

第二，試劑層干燥后，按比例將TiO2粘合劑進行混合，噴涂在試劑層上，形成擴散層。干燥后，完成H2O2干化學檢測片的制作。將其剪裁成7mm×7mm的正方形，置入檢測卡底內，形成H2O2干化學檢測卡。

3 過氧化氫檢測卡的性能驗證

3.1 H2O2干化學測定方法的建立

3.1.1 標準曲線。將3.0%的H2O2稀釋成濃度為1.25、2.5、5.0、10.0、20.0mg/L備用。分別取10μL不同濃度H2O2的標本液體，將其均勻地加在H2O2干化學檢測卡中，蒸餾水做空白對照，置于具有25℃恒溫功能的漫反射光電比色儀上10min，測定結果以電位值（mV）表示，以空白對照干片測定值為基準值減去其他各測定值，得出各對應過氧化氫濃度的檢測相對值，建立標準曲線。H2O2干化學檢測卡標準曲線如圖1所示，在2.0～20.0mg/L范圍內線性較好，[R2]=0.987 2。

3.1.2 樣本測定。取13份未知濃度H2O2樣品，按檢測方法測定相對值，在標準曲線上查找對應的過氧化氫濃度。

3.2 方法的精密度和準確度實驗

在過氧化氫濃度為3.9mg/L和15.5mg/L兩份樣品中，添加3.0mg/L的H2O2，觀察干化學檢測卡方法的精密度和準確度。使用H2O2干化學檢測卡（批號：2019003）加樣10μL，各測定10次，結果如表1所示。兩個濃度H2O2檢測精密度分別為3.5%和3.2%，準確度分別為98.2%和102.2%。

3.3 過氧化氫檢測卡與國家標準的比對實驗

分別用國家標準方法《食品安全國家標準 食品中過氧化氫殘留量的測定》（GB 5009.226—2016）的鈦鹽比色法和過氧化氫干化學檢測卡對13份不同同濃度的過氧化氫進行測定，觀察過氧化氫干化學檢測方法與國家標準方法的相關性，結果采用SPSS.20統計軟件對兩方法進行配對t檢驗分析，結果如圖2所示。

實驗結果顯示，國標方法與氧化氫干化學檢測方法的兩組數據經配對t檢驗統計，差異不顯著（[t0.09<t0.05（24）=2.064]，P>0.05），相關系數為0.998 5，證明過氧化氫干化學分析方法與國家標準方法具有較好的相關性。

4 討論

目前，對食品安全、環境污染等監測已趨向于現場快速檢測[9]。其中，采用干化學（Dry Chemistry）檢測是主要應用方式，在食品安全、環境污染和臨床化學等檢測中具有較大的應用的空間[10-12]。劉丹[13]、楊惠宇[14]通過將生化試劑固定在高分子膜載體上來制備干片，制備的干片包括血紅蛋白干片、白蛋白干片、總蛋白干片。本文制備的H2O2干化學檢測卡是基于反射光度法原理，以二氧化鈦（TiO2）和聚乳酸高分子微球為試劑載體，通過試劑分層包埋制備干片，實現了過氧化氫的快速、靈敏檢測。

與國家標準的比對實驗相關系數為0.998 5，證明該方法具有較好的靈敏度和精密度，為過氧化氫的快速檢測提供了一種新方法。

參考文獻：

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