女貞子提取物對破骨細胞分化及成骨細胞增殖的影響

雷麗娟　楊曉琴　周英　王慧娟　陳麗珍　俸婷婷

中圖分類號 R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）16-2247-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.16.17

摘 要 目的：探討女貞子提取物對破骨細胞分化及成骨細胞增殖的影響。方法：以1α，25-二羥基維生素D3誘導兔原代骨髓細胞獲取破骨細胞，經(jīng)女貞子醇提物和水煎物低、中、高劑量（均為2、20、200 mg/L）處理后，采用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）活性測定法檢測各組細胞裂解液中TRACP活性及細胞中TRACP陽性細胞數(shù)，采用甲苯胺藍染色法檢測各組細胞骨吸收陷窩數(shù)量及骨陷窩面積百分率。以L-抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、地塞米松誘導小鼠顱頂前成骨細胞亞克隆14細胞獲取成骨細胞，采用MTT法檢測各組細胞的相對增殖率，采用堿性磷酸酶（APK）活性測定法檢測各組細胞中APK活性。結(jié)果：經(jīng)不同劑量女貞子提取物處理后，TRACP陽性細胞數(shù)、骨吸收陷窩數(shù)量及其面積均有不同程度的改變，其中女貞子醇提物各劑量組和水煎物高劑量組TRACP活性及陽性細胞數(shù)、骨吸收陷窩數(shù)量及面積百分率，以及女貞子水煎物中劑量組TRACP活性及陽性細胞數(shù)、骨陷窩面積百分率均顯著降低或減少，而水煎物低劑量組細胞的骨吸收陷窩數(shù)量顯著增多（P<0.05或P<0.01）;女貞子提取物低、中劑量組細胞的相對增殖率以及提取物各劑量組細胞的APK活性均顯著升高，而女貞子提取物高劑量組細胞的相對增殖率均顯著降低（P<0.01）。結(jié)論：女貞子提取物可抑制破骨細胞的TRACP活性，改變破骨細胞的骨吸收功能和成骨細胞的增殖行為，并增加成骨細胞的APK活性。

關(guān)鍵詞 女貞子;醇提物;水煎物;破骨細胞;成骨細胞;骨吸收;分化;增殖

Effects of Ligustri lucidi Fructus Extract on the Differentiation of Osteoclasts and the Proliferation of Osteoblasts

LEI Lijuan1，2，3，YANG Xiaoqin1，2，3，ZHOU Ying2，3，4，WANG Huijuan2，3，CHEN Lizhen2，3，F(xiàn)ENG Tingting2，3，4（1. School of Pharmaceutical Science， Guizhou University， Guiyang 550025， China; 2. Research and Development Center for Medicinal and Edible Plant Resources of Guizhou， Guiyang 550025， China; 3. Medicinal and Edible Plant Resources Application and Development Engineering Laboratory of Guizhou， Guiyang 550025， China; 4. Pharmacy School， Guiyang College of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550025， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the effects of Ligustri lucidi Fructus extract on the differentiation of osteoclasts and the proliferation of osteoblasts. METHODS： Rabbit primary bone marrow cells were induced with 1a，25-Dihydroxyvitamin D3 to obtain osteoclasts. After treated with low-dose， medium-dose and high-dose of L. lucidi Fructus ethanol and water extract （both 2， 20， 200 mg/L）， TRACP activity determined method was used to detect the activity of TRACP in cell lysis solution and the number of TRACP positive cells. The number of celluar bone resorption lacunae and the percentage of bone lacunae area were detected by toluidine blue staining. Osteoblasts were obtained by L-ascorbic acid， β-sodium glycerophosphate and dexamethasone-induced subcloning 14 of cranial parietal anterior osteocytes in mice. MTT assay and APK activity assay were used to detect relative proliferation rate of cells and the activity of APK. RESULTS： After treated with different doses of L. lucidi Fructus extract， the number of TRACP positive cells， the number of bone resorption lacunae and their area were changed in varying degrees. TRACP activity， the number of its positive cells， the number of bone resorption lacunae and the percentage of bone lacunae area in different dosage groups of L. lucidi Fructus ethanol extract and high-dose of water extract; the TRACP activity， the number of its positive cells and the percentage of bone lacunae area in L. lucidi Fructus water extract medium-dose group were decreased significantly， while the number of bone resorption lacunae in L. lucidi Fructus water extract low-dose group was increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. The relative proliferation rate of cells in L. lucidi Fructus extract low-dose and medium-dose groups and APK activity of cells in extract groups were significantly increased， while the relative proliferation rate of cells were decreased significantly in L. lucidi Fructus ethanol extract and water extract high-dose groups （P<0.01）. CONCLUSIONS： L. lucidi Fructus extract can inhibit TRACP activity of osteoclasts， change the bone resorption function of osteoclasts and the proliferation behavior of osteoblasts and increase APK activity of osteoclasts.

KEYWORDS? ?Ligustri lucidi Fructus; Ethanol extract; Water decoction; Osteoclasts; Osteoblasts; Bone resorption; Differentiation; Proliferation

女貞子（Ligustri lucidi Fructus）為木犀科植物女貞（Ligustrum lucidum Ait.）的干燥成熟果實，含有女貞子苷、洋橄欖苦苷、齊墩果酸、4-羥基-β-苯乙基-β-D-葡萄糖苷、樺木醇等活性成分[1]。該藥材性涼，味甘、苦，歸肝、腎經(jīng)，具有滋補肝腎、明目烏發(fā)之功效，可用于治療眩暈耳鳴、腰膝酸軟、須發(fā)早白、目暗不明等癥，其主要藥理作用包括抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松（OP）、抗氧化、抗衰老、增強免疫力、升高白細胞、保肝強心等[1-2]。其中，抗腫瘤、抗OP作用是該藥材近幾年研究的熱點之一。中醫(yī)認為，骨由腎主導，治療OP應從補益肝腎、強腰健膝、益氣養(yǎng)血、活血化瘀等方面入手[3]。因此，女貞子及其活性成分具有被開發(fā)為抗OP藥物的潛力。

OP是以骨量減少，骨微結(jié)構(gòu)破壞，骨強度下降，松質(zhì)骨骨小梁變細、斷裂、數(shù)量減少，皮質(zhì)骨多孔和變薄導致骨脆性增加，容易發(fā)生骨折及骨痛為特征的全身性骨代謝疾病，其發(fā)病機制與破骨細胞分化增強以及成骨細胞增殖減弱有關(guān)[4]。破骨細胞在維持骨代謝平衡過程中可發(fā)揮重要作用，該細胞由骨髓細胞經(jīng)核因子κB受體活化因子配體（RANKL）和巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）共同刺激后分化而成，其異常分化時可造成骨吸收過度而導致骨量減少，進而引發(fā)OP[5]。成骨細胞則由間充質(zhì)干細胞發(fā)育而成，可分泌細胞外基質(zhì)，在骨微環(huán)境下礦化為骨基質(zhì)，并進一步分化成熟形成骨細胞，主要參與骨的形成以及骨損傷的修復過程[6-7]。由此可見，調(diào)節(jié)破骨細胞的分化和成骨細胞的增殖可作為治療OP的手段之一。鑒于此，本研究以1α，25-二羥基維生素D3[1α，25-（OH）2VitD3]誘導兔原代骨髓細胞獲得破骨細胞，以L-抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、地塞米松誘導小鼠顱頂前成骨細胞亞克隆14細胞（MC3T3-E1Subclone 14）獲得成骨細胞，并在此基礎上初步探討女貞子提取物對破骨細胞分化和成骨細胞增殖的影響，以期為女貞子防治OP提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

3111型CO2培養(yǎng)箱、1510型酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）;XD20-RFL型倒置熒光相差顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司）;LGJ-12型冷凍干燥機（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;WH-2型微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）;KH-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

女貞子飲片（酒制，貴州同濟堂中藥飲片有限公司，批號：110502）經(jīng)貴州大學生命科學學院熊源新教授鑒定為木犀科植物女貞（L. lucidum Ait.）的干燥成熟果實。

破骨細胞α-MEM培養(yǎng)基、成骨細胞α-MEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號分別為1148795、1510464）;甲苯胺藍染色液（批號：BCBG4799V）、胎牛血清（批號：140502）、L-抗壞血酸（批號：A7506）、β-甘油磷酸鈉（批號：G5422）、地塞米松對照品（批號：D1756，純度：≥98%）均購自美國Sigma公司;青霉素/鏈霉素雙抗（批號：20140718）、MTT試劑（批號：46170204106）均購自北京索萊寶科技有限公司;谷氨酰胺對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100968-201001，純度：100%）;1α，25-（OH）2VitD3對照品（批號：096M4039V，純度：≥98%）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）測試盒及其染色試劑盒（批號分別為20140805、SLBJ7300V）、堿性磷酸酶（AKP）測試盒（批號：20150809）均購自日本Sigma公司;二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量測定試劑盒（批號：20140803）、Tritonx-100裂解液（批號：M2528）均購自美國MP Biomedicals公司;4%中性甲醛溶液（南京建成生物工程研究所，批號：20160115）;胰酶（美國Amresco公司，批號：1812C306）;其余試劑均為分析純，水為自制純化水。

1.3 動物

出生48 h內(nèi)的清潔級新西蘭乳兔，雌雄不限，體質(zhì)量（120±10）g，由貴陽經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)鵬程農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，動物生產(chǎn)合格證號：SCXK（黔）2012-001。

1.4 骨磨片與細胞

骨磨片（批號：20161015）由蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院骨科研究所提供;MC3T3-E1Subclone 14細胞由中國科學院細胞庫提供。

2 方法

2.1 女貞子提取物的制備

稱取女貞子飲片100 g，用75%乙醇加熱回流提取3次（1 000 mL/次），每次3 h，抽濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，所得浸膏經(jīng)冷凍干燥后，即得女貞子醇提物樣品（15.23 g，提取率為15.23%）。另稱取女貞子飲片100 g，用水煎煮3次（1 000 mL/次），每次分別煎煮2.5、2、1.5 h，抽濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，所得浸膏經(jīng)冷凍干燥后，即得女貞子水煎物樣品（23.83 g，提取率為23.83%）。上述提取物均置于4 ℃冰箱中保存，備用。

2.2 骨髓細胞的分離與誘導培養(yǎng)

參照文獻方法[8]分離骨髓細胞：脫頸處死出生48 h內(nèi)的乳兔，于無菌條件下剝離其后肢脛骨和股骨，置于4 ℃磷酸鹽緩沖液（PBS，pH為7.2～7.3）中，去除骨周圍的軟組織，將骨干置于破骨細胞α-MEM完全培養(yǎng)基（即含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素雙抗、1%谷氨酰胺的破骨細胞α-MEM培養(yǎng)基，下同）中，縱向剖開骨干，用無菌刀片輕刮其內(nèi)表面至顏色變白;將完全培養(yǎng)基及骨渣渦旋振蕩，過200目篩后制成細胞懸液，以1×106～2×106個/孔的密度接種至24孔板（可根據(jù)試驗需要預先放置骨磨片）中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱（下同）中培養(yǎng)24 h;用PBS洗掉未貼壁的細胞，再加入含1×10-8 mol/L 1α，25-（OH）2VitD3的完全培養(yǎng)基中進行誘導，記為培養(yǎng)的第1天，之后每隔3天更換1次培養(yǎng)基，并采用自然沉降法[9]篩選出骨髓細胞（即形態(tài)統(tǒng)一，且呈梭狀分布者）。

2.3 女貞子提取物對破骨細胞分化的影響

采用TRACP活性測定法檢測。取“2.2”項下對數(shù)生長期的骨髓細胞適量，按5×103個/孔的密度接種于96孔板（勿需骨磨片）中，培養(yǎng)24 h。將細胞隨機分為空白對照組，女貞子醇提物低、中、高劑量組（2、20、200 mg/L，按醇提物質(zhì)量計，以DMSO為溶劑;劑量設置參考前期預試驗結(jié)果，下同），女貞子水煎物低、中、高劑量組（2、20、200 mg/L，以水煎物質(zhì)量計，以DMSO為溶劑;劑量設置參考前期預試驗結(jié)果，下同），每組設置6個復孔。吸棄上清液，空白對照組加入含1×10-8 mol/L 1α，25-（OH）2VitD3的破骨細胞α-MEM完全培養(yǎng)基100 μL，各給藥組加入含相應藥物和1×10-8 mol/L 1α，25-（OH）2VitD3的破骨細胞α-MEM完全培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)。于培養(yǎng)的第8天，使用0.2%TritonX-100裂解液裂解各孔細胞30 min，取裂解液20 μL，按TRACP測試盒說明書處理后，使用酶標儀于530 nm波長處檢測各孔的吸光度（A）值，并參照測試盒說明書方法換算TRACP活性[每升裂解液與測試盒底物于37 ℃反應1 min產(chǎn)生1 μmol游離酚即為1個活力單位（U/L）]。同時，將細胞以PBS清洗后，于4%中性甲醇溶液中固定1 min，再用水清洗，輕輕甩干后，參照TRACP染色試劑盒說明書進行染色，使用顯微鏡進行觀察，記錄TRACP陽性細胞數(shù)（陽性細胞的胞漿呈紅色）。上述試驗重復3次。

2.4 女貞子提取物對破骨細胞骨吸收功能的影響

采用甲苯胺藍染色法檢測。按“2.3”項下方法分組、給藥、培養(yǎng)（需骨磨片），每隔2天更換1次培養(yǎng)基。于培養(yǎng)的第8天，棄去培養(yǎng)基，將骨磨片用PBS清洗后，于10%中性甲醛溶液中固定10 min，再用0.25 mol/L氨水超聲（功率：500 W，頻率：40 kHz）清洗3次，每次5 min;經(jīng)乙醇梯度脫水后，用1%甲苯胺藍染色，再用水清洗，自然晾干;使用顯微鏡進行觀察，采用Image Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計骨吸收陷窩（鏡下呈紫紅色）數(shù)量和骨陷窩面積百分率[骨陷窩面積百分率（%）=骨陷窩面積/整張骨磨片面積×100%]。上述試驗重復3次。

2.5 女貞子提取物對成骨細胞增殖的影響

采用MTT法檢測。取對數(shù)生長期的MC3T3-E1Subclone l4細胞，以5×103個/孔的密度接種于96孔板（勿需骨磨片）中，培養(yǎng)24 h后，用PBS洗掉未貼壁的細胞。將細胞隨機分為空白對照組，女貞子醇提物低、中、高劑量組，女貞子水煎物低、中、高劑量組，并設置不含細胞和藥物的陰性對照組，每組設置6個復孔。吸棄上清液，空白對照組和陰性對照組加入成骨細胞α-MEM完全培養(yǎng)基（含50 μg/mL L-抗壞血酸、10 mmol/mL β-甘油磷酸鈉、10-8 mol/mL地塞米松的成骨細胞α-MEM培養(yǎng)基，下同）100 μL，各給藥組加入含相應藥物的成骨細胞α-MEM完全培養(yǎng)基100 μL，培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)基，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，培養(yǎng)4 h后，吸棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，使用酶標儀于490 nm波長處檢測各孔的A值，計算各組細胞的相對增殖率[相對增殖率（%）=（給藥組平均A值-空白對照組平均A值）/（空白對照組平均A值-陰性對照組平均A值）×100%]。上述試驗重復3次。

2.6 女貞子提取物對成骨細胞APK活性的影響

采用APK活性測定法[10-11]檢測。取對數(shù)生長期的MC3T3-E1Subclone 14細胞，以1×104個/孔的密度接種于96孔板（勿需骨磨片）中，培養(yǎng)24 h后，用PBS洗掉未貼壁的細胞。按“2.5”項下方法分組（不設置陰性對照組）、給藥，每組設置4個復孔。培養(yǎng)72 h后，吸棄培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，使用1%TritonX-100裂解液于4 ℃下裂解30 min。取各孔裂解后的細胞適量，按AKP測試盒說明書處理后，使用酶標儀于520 nm波長處檢測各孔的A值;采用BCA法測定各組細胞的蛋白濃度，并將A值換算AKP活性[每克組織蛋白與測試盒底物于37 ℃反應15 min產(chǎn)生1 mg游離酚即為1個活性單位（U/g prot）]。上述試驗重復3次。

2.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 女貞子提取物對破骨細胞分化和骨吸收功能的影響

3.1.1 TRACP活性及其陽性細胞數(shù) 空白對照組TRACP陽性細胞較多，且體積較大。與空白對照組比較，各給藥組TRACP陽性細胞均有不同程度的減少;其中女貞子醇提物各劑量組和水煎物中、高劑量組細胞的TRACP活性均顯著降低，TRACP陽性細胞數(shù)均顯著減少，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），詳見圖1、表1。

3.1.2 骨吸收功能 空白對照組骨吸收陷窩數(shù)量較多，且面積較大。與空白對照組比較，各給藥組骨吸收陷窩數(shù)及面積均有不同程度的變化;其中，女貞子醇提物各劑量組和水煎物高劑量組細胞的骨吸收陷窩數(shù)量及骨吸收陷窩面積百分率，以及水煎物中劑量組細胞骨陷窩面積百分率均顯著減少或降低，而水煎物低劑量組細胞骨吸收陷窩數(shù)量顯著增多，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），詳見圖2、表1。

3.2 女貞子提取物對成骨細胞增殖的影響

與空白對照組比較，女貞子醇提物和水煎物低、中劑量組細胞的相對增殖率（>0）均顯著升高，而兩者高劑量組細胞的相對增殖率（<0）均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），詳見表2。

3.3 女貞子提取物對成骨細胞APK活性的影響

與空白對照組比較，女貞子醇提物和水煎物各劑量組細胞的APK活性均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），詳見表2。

4 討論

現(xiàn)代藥理研究表明，女貞子具有保肝、調(diào)節(jié)免疫、強心、抗炎、抗OP及抗腫瘤等作用，且其多種活性成分（如齊墩果酸、熊果酸、紅景天苷、環(huán)烯醚萜苷、酪醇特女貞苷等）都具有抗OP的活性[12-13]。目前學者普遍認為，女貞子提取物可通過促進成骨細胞分化、阻滯破骨細胞激活或增殖、抑制基質(zhì)金屬酶表達等途徑來發(fā)揮抗OP作用[14-15]，但目前尚鮮見其對破骨細胞分化及成骨細胞增殖影響的相關(guān)報道。

本研究以1α，25-（OH）2VitD3誘導兔原代骨髓細胞來獲取破骨細胞，以抗壞血酸、甘油磷酸鈉、地塞米松誘導MC3T3-E1Subclone 14細胞來獲取成骨細胞，初步探討了不同劑量女貞子醇提物和水煎物對破骨細胞分化及骨吸收功能、破骨細胞增殖及相關(guān)酶活性的影響。1α，25-（OH）2VitD3是參與破骨細胞形成與激活過程的必要因子，可通過誘導骨髓干細胞分化而形成破骨細胞;同時，其可誘導破骨細胞前體細胞（如骨髓單核細胞）形成陽性多核細胞，并使破骨細胞具有骨吸收功能[16]。其中，TRACP活性可用以衡量破骨細胞分化及其骨吸收能力，該酶被公認為破骨細胞的標志性酶[17]。此外，骨吸收陷窩是破骨細胞骨吸收直接作用的結(jié)果，其數(shù)量及面積大小亦可直接反映破骨細胞的骨吸收功能[18]。為此，本研究考察了女貞子提取物對破骨細胞分化和骨吸收功能的影響。結(jié)果顯示，女貞子醇提物及水煎液各劑量組TRACP陽性細胞、骨吸收陷窩數(shù)及面積均有不同程度的變化，其中女貞子醇提物各劑量組和水煎物高劑量組的TRACP活性及陽性細胞數(shù)、骨吸收陷窩數(shù)量及面積百分率，以及水煎物中劑量組的TRACP活性及陽性細胞數(shù)、骨吸收陷窩面積百分率均較空白對照組均顯著降低或減少，而水煎物低劑量組細胞的骨吸收陷窩數(shù)量顯著增多。這提示不同劑量女貞子提取物可不同程度地抑制破骨細胞分化，且醇提物和水煎物對其骨吸收功能的影響存在差異，這可能與提取物中的成分差異有關(guān)，但有待后續(xù)研究予以證實。

當骨吸收大于骨形成時，可使機體骨量丟失從而導致OP等相關(guān)骨疾病的發(fā)生[4]。成骨細胞是骨形成的物質(zhì)基礎，其增殖可產(chǎn)生豐富的膠原基質(zhì)，并通過礦化作用形成更多的骨質(zhì)，因此調(diào)節(jié)成骨細胞增殖可能是治療OP的途徑之一[19]。MC3T3-E1Subclone 14細胞是一種亞克隆體，主要是由表型各異的MC3T3-E1細胞系分離克隆而得，其增殖行為與顱頂前成骨細胞類似，是體外研究的理想模型[20]。為此，本研究采用MC3T3-E1Subc- lone 14細胞誘導獲得成骨細胞，并考察了女貞子提取物對成骨細胞增殖的影響。結(jié)果顯示，女貞子提取物低、中劑量組細胞的相對增殖率（>0）均較空白對照組顯著升高，而提取物高劑量組細胞的相對增殖率（<0）均較空白對照組顯著降低。這提示不同劑量女貞子提取物可改變成骨細胞的增殖行為，且中、低劑量的女貞子提取物可促進成骨細胞的增殖，而高劑量則可抑制成骨細胞的增殖。APK是參與骨代謝的同源二聚體糖蛋白，可促進細胞的成熟與鈣化，被認為是細胞外基質(zhì)成熟的早期標志[21]，且由于該酶的表達也會隨著細胞分化而增強，故其活性也是評估成骨細胞增殖的指標之一[22]。為此，本研究考察了女貞子提取物對APK活性的影響。結(jié)果顯示，女貞子醇提物和水煎物各劑量組細胞APK活性均較空白對照組顯著升高。這提示不同劑量女貞子提取物均可明顯提高成骨細胞中APK的活性。

綜上所述，女貞子提取物可抑制破骨細胞分化，并可改變破骨細胞的骨吸收功能和成骨細胞的增殖行為，可為女貞子的抗OP作用提供理論基礎，但其具體機制、作用劑量和活性成分仍有待后續(xù)深入研究。

參考文獻

[ 1 ] 張明發(fā)，沈雅琴.女貞子及其有效成分的保肝作用研究進展[J].藥物評價研究，2014，37（3）：280-284.

[ 2 ] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：45-46.

[ 3 ] 陳麗珍，周英，黃俊飛，等.大血藤對破骨細胞活性及成骨細胞增殖分化作用的研究[J].中國中藥雜志，2015，40（22）：4463-4468.

[ 4 ] KAWAHARA M，IWASAKI Y，SAKAGUCHI K，et al. Involvement of GCMB in the transcriptional regulation of the humanparathyroid hormone gene in a parathyroid-derived cellline PT-r：effects of calcium and 1，25（OH）2D3 [J]. Bone，2010，47（3）：534-541.

[ 5 ] 陳曉虎，孫瑜隆，騫愛榮，等.破骨細胞的形成和活化研究進展[J].中國細胞生物學學報，2014，36（2）：258-266.

[ 6 ] 秦臘梅，肖永華，周麗珍，等. 4味中藥對體外培養(yǎng)成骨樣細胞增殖的影響：對通補強骨方中主要組成藥物的研究[J].中國實驗方劑學雜志，2002，8（2）：18-21.

[ 7 ] ENSRUD KE，CRANDALL CJ. Osteoporosis[J]. Ann Intern Med，2018. DOI：10.7362/L17-0587.

[ 8 ] 甄茹，俸婷婷，趙致，等.黒骨藤抑制破骨細胞分化及骨吸收能力的活性部位研究[J].中國實驗方劑學雜志，2015，21（1）：112-116.

[ 9 ] MING LG，LV X，MA XN，et al. The prenyl group contri- butes to activities of phytoestrogen 8-prenynaringenin in enhancing bone formation and inhibiting bone resorption in vitro[J]. Endocrinology，2013，154（3）：1202-1214.

[10] XU L，XU W，XU G，et al. Effects of cell surface α2-3? ? sialic acid on osteogenesis[J]. Glycoconj J，2013，30（7）：677-685.

[11] SUH KS，LEE YS，SEO SH，et al. Effect of zinc oxide nanoparticles on the function of MC3T3-E1 osteoblastic cells[J]. Biol Trace Elem Res，2013，155（2）：287-294.

[12] 劉亭亭，王萌.女貞子化學成分與藥理作用研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20（14）：228-234.

[13] 劉先芳，梁敬鈺，孫建博，等.女貞子化學成分和藥理活性研究進展[J].海峽藥學，2018，30（1）：1-8.

[14] DONG XL，ZHANG Y，F(xiàn)AVUS MJ，et al. Ethanol extract of Fructus Ligustri lucidi increase circulating 1，25-dihydroxyvitamin D3 by inducing renal 25-hydroxyvitamin D-1α hydroxylase activity[J]. Menopause，2010，17（6）：1174- 1181.

[15] LI G，ZHANG XA，ZHANG JF，et al. Ethanol extract of Fructus Ligustri luidi promotes osteogenesis of mesenchymal stem cells[J]. Phytother Res，2010，24（4）：571-576.

[16] 葛冬霞，李良，吳江，等. 1，25（OH）2維生素D3誘導大鼠骨髓單核細胞形成破骨細胞[J].四川大學學報（醫(yī)學版），2007，38（2）：213-216.

[17] 楊榮平，鄧改改，羅友成，等.青娥丸不同萃取部位對成骨細胞增殖分化及破骨細胞活性的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2011，22（11）：2588-2590.

[18] 呂享，周英，陳克明，等. 8-異戊烯基柑橘素抑制骨髓細胞向破骨細胞分化及骨吸收活性[J].藥學學報，2013，48（3）：347-351.

[19] LIU Y，CUI L，WU T，et al. Effects of emodin on the proliferation and differentiation of osteoblast isolated from neonatal rat calvarium in vitro[J]. Chin Pharmacol Bull，2005，21（2）：235-240.

[20] 鄭磊，徐貴英，徐嵐，等. MC3T3-E1Subclone4體外誘導成骨細胞模型的建立[J].中國血液流變學雜志，2012，22（1）：16-19.

[21] ZHANG JF，LI G，CHAN CY，et al. Flavonoids of herba Epimedii regulate osteogenesis of huamn mesenchymal stem cells through BMP and Wnt/β-catenin signaling pathway[J]. Mol Cell Endocrinol，2010，314（1）：70-74.

[22] 張英，袁月，孫富麗.成骨細胞胞內(nèi)胞外堿性磷酸酶含量比較[J].中國醫(yī)科大學學報，2011，40（10）：874-876、884.

（收稿日期：2018-10-11 修回日期：2019-05-10）

（編輯：張元媛）