牛黃對1型糖尿病小鼠主動脈僵硬度和內皮功能障礙的影響

劉鋒 馬艷芳 張靜

摘要?目的：研究牛黃的主要成分牛磺酸（Taurine）對1型糖尿病小鼠主動脈僵硬度和內皮功能障礙的影響。方法：健康的雄性C57BL/6J小鼠30只，隨機分為CON組、MD組和MD+牛磺酸組，每組10只。采用SphygmoCor脈搏分析系統分析主動脈脈搏流速（APV）m/s、主動脈脈搏波增強指數（API）和主動脈脈搏波增強指數（AIX）等指標反映主動脈僵硬度;采用氧化酶法、放射免疫法分別檢測血清葡萄糖水平和胰島素含量;根據血管周圍組織內皮依賴性擴張（EDD%）和內皮獨立擴張（EID%）評價主動脈內皮功能;采用RT-PCR法、Western blot方法對胸主動脈組織細胞eNOS mRNA表達水平及eNOS在不同處理組細胞中蛋白表達情況進行測定。結果：MD組（MD組）與正常對照組（CON組）比較，其主動脈內膜破壞嚴重，內皮細胞的體積增大，甚至部分脫落和間隙增大，中膜平滑肌細胞排列紊亂。與MD組比較，MD+TUDCA組（MD+牛磺酸）組主動脈壁各層細胞的排列較整齊，病變減輕。MD+牛磺酸組小鼠體質量及空腹血清胰島素水平差異無統計學意義（P>0.05），而空腹血糖升高至（22.4±4.6）mmol/L，ISI降低（P<0.05）;且APV、API和AIX均減輕或降低，差異有統計學意義（P<0.05）。與MD比較，MD+牛磺酸組eNOS mRNA表達上調，牛磺酸可提高eNOS蛋白水平的表達（P<0.01）。結論：長期服用牛磺酸對1型糖尿病小鼠主動脈僵硬度有改善作用，還可以通過增加機體一氧化氮活性和提高機體抗氧化能力從而預防小鼠內皮功能障礙，其可能是治療及預防糖尿病血管功能障礙的有效藥物。

關鍵詞?牛磺酸;1型糖尿病;內皮功能;主動脈硬化;脈搏波速度;血管周圍組織

Effects of Taurine on Aortic Stiffness and Endothelial Dysfunction in Type 1 Diabetic Mice

Liu Feng， Ma Yanfang， Zhang Jing

（Department of Pediatrics， Affiliated Hospital of Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang 712083，China）

Abstract?Objective：To study the effects of the main component of Calculus Bovis， Taurine on aortic stiffness and endothelial dysfunction in type 1 diabetic mice.Methods：A total of 30 healthy male C57BL/6J mice were randomly divided into a CON group（n=10）， a MD group（n=10）and a MD+ Taurine group（n=10）.Aortic pulse velocity（APV）m/s， aortic pulse wave enhancement index（API）and aortic pulse wave enhancement index（AIX）were analyzed by SphygmoCor pulse analysis system to reflect aortic stiffness.Oxidase and radioimmunoassay were used to measure serum glucose levels and insulin levels， respectively.According to the endothelial-dependent dilation（EDD%）and endothelial-independent dilation（EID%）， the endothelial functionob in peripheral tissues was evaluated.The expression level of eNOS mRNA in aortic tissue and expression of eNOS protein in cells of different treatment groups were measured by RT-PCR and Western blot.Results：Compared with the normal control group（CON group）， the model group（MD group）mice showed more serious aortic intima destruction， the volume of endothelial cells was significantly increased， even partial shedding， and the arrangement of mesangial smooth muscle cells was disordered.Compared with the MD group， cells in the aortic wall of the sulfonated deoxycholic acid intervention group（MD+Taurine）were arranged orderly and the lesions were significantly reduced.There was no significant difference in body weight and fasting serum insulin level（P>0.05）.However， fasting blood glucose was significantly increased to （22.4±4.6）mmol/L， while ISI， APV， API and AIX were reduced or decreased， with statistically significant differences（P<0.05）.Compared with MD group， eNOS mRNA expression in MD+Taurine group was significantly increased.The results indicated that the expression level of eNOS protein was significantly increased by sulphuric deoxycholic acid and the difference was statistically significant（P<0.01）.Conclusion：Sulfonic deoxycholic acid has an effect on aortic stiffness in type 1 diabetic mice， and it can prevent endothelial dysfunction in mice by increasing nitric oxide activities and increasing antioxidant capacity.It may be an effective medicine for the prevention and treatment of diabetic vascular dysfunction.

Key Words?Taurine; Diabetes mellitus type 1; Endothelial function; Arteriosclerosis; Aorta pulse wave velocity; Perivascular tissue

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.12.018

目前，1型糖尿病（Type 1 Diabetes Mellitus，T1DM）患者的數量有增無減，在美國2 500多萬人患有T1DM，另外，還有5 000萬人診斷屬于糖尿病前期[1]。在眾多與T1DM相關的疾病中，心血管疾病（Cardiovascular Disease，CVD）是最常見和最嚴重的。T1DM患者一生中發生CVD的可能性是非糖尿病患者的兩倍多，CVD是糖尿病患者最常見的死亡原因，占糖尿病相關死亡的近70%[2-3]。連接T1DM和CVD的關鍵之一是血管功能障礙的發展，尤其是血管功能障礙的2個組成部分導致與糖尿病相關的CVD，包括動脈硬化和內皮功能障礙。動脈硬化和內皮功能障礙都是心血管疾病的臨床表現，兩者都是未來T1DM心血管事件的獨立預測因子[4-6]。因此，許多專家學者為確定糖尿病動脈硬化和內皮功能障礙的潛在原因已經作出了相當大的努力。盡管付出很大的努力，但導致其發展的起始事件仍不清楚。

一氧化氮合成酶（Nitric Oxide Synthase，eNOS）首次由Forstermann和Poiiock在內皮細胞中發現，其廣泛有于血管內皮細胞、血小板、腎小管上皮細胞和一些能產生少量一氧化氮的其他類型細胞，一種旨在恢復內質網穩態[7]的自適應通路。雖然eNOS是防御內質網應激的第一道防線，但eNOS的慢性激活會導致細胞功能障礙和死亡，它已被牽連到心包代謝疾病的病理生理學[8-9]。eNOS應激的治療方法，如化學伴侶牛磺酸（牛磺酸），已被證明可以緩解與內質網應激相關的幾種心血管代謝疾病[10-11]。

中醫學理論認為動脈僵硬度的增加和痰濁與瘀血密不可分，心主血脈，肺朝百脈，肝藏血，腎藏精，精血同源，因此痰濁與瘀血的發生同肺脾腎三臟功能的失常具有重要關系，痰濁和瘀血是動脈粥樣硬化引發的臨床表現。牛黃（Calculus Bovis）有益氣強心、溫通化濕的功效。牛黃的主要成分牛磺酸可以增加心肌的缺氧耐受性，增強冠狀動脈的血液流量減少冠脈痙攣的發生;能清除體內自由基，減少炎性反應性反應的發生，有效減少心肌的耗氧量;可提高心肌的收縮能力。因此，本研究旨在探討牛磺酸（Taurine）對T1DM小鼠主動脈僵硬度和內皮功能障礙的影響。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物?健康的雄性C57BL/6J小鼠30只，體質量（200～250）g，飼養于屏障系統的動物房，光照周期12 h，溫度（25±3）℃，相對濕度55%～60%。所有大鼠正常活動，每天自由飲水及進食。所有的實驗動物程序都符合動物護理和使用委員會的審查和批準。

1.1.2?藥物?牛磺酸注射液（重慶制藥六廠，生產批號018254）;生理鹽水（上海信誼藥廠，生產批號：019433）。

1.1.3?試劑與儀器?Trizol（Life Technologies，Grand Island，NY，USA）;SphygmoCor脈搏分析系統;壓力肌電室（DMT Inc.，亞特蘭大，GA，美國）;小動物監護儀（MouseMonitor S，Indus Instruments，美國）;iScript（美國Bio-Rad大力神，CA）;二辛可寧酸蛋白質測定試劑盒（Pierce Biotechnology，USA）。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備?T1DM模型NOD小鼠（動物的來源：中國嚙齒類實驗動物中心上海分公司;體質量18～22 g;8周齡）。生物學特性：NOD小鼠自身免疫性胰島炎最早發生于4周齡，于12周齡時出現明顯糖尿病癥狀。發病后，在幾周的時間內，血糖迅速升高，飲水量劇增，大量地排尿，體質量迅速下降，在這個過程中，患鼠血糖呈先迅速上升，后逐步下降，但仍維持高于正常值的狀態，體質量直線下降，最后昏迷而死亡。判定指標：NOD糖尿病小鼠與同周齡正常NOD小鼠比較，體質量明顯減輕，血糖明顯升高。采尾血檢測小鼠空腹血糖，空腹血糖≥16.7 mmol/L則模型成功。將制備成功的T1DM小鼠20只隨機分為MD組（10只）;經腹腔注射牛磺酸組（10只）于STZ用藥1周后開始每日250 mg/kg，連續4周。在4周的干預后，所有小鼠大約6個月大時被處死。小鼠分為3組：1）CON組;2）MD組;3）MD+TUDCA組，每組小鼠10只。

1.2.2?干預方法?用異氟醚麻醉小鼠，心臟穿刺抽血處死小鼠。在冰冷生理鹽水（PSS：0.288 g NaH2PO4，1.802 g葡萄糖，0.44 g丙酮酸鈉，20.0 g BSA，21.48 g NaCl，0.875 g KCl，0.7195 g MgSO4·7H2O，13.9 g MOPS鈉鹽在pH值7.4下，每升溶液EDTA為0.185 g，并在液氮中閃凍，以供日后分析。簡單地說，頸動脈和二級腸系膜動脈在冰冷的PSS中切除，放置在裝有熱PSS的壓力肌電室（DMT Inc.，亞特蘭大，GA，美國）中，置入玻璃微管，用縫合線固定。

1.2.3?檢測指標與方法

1.2.3.1?血清生化指標測定?小鼠檢測體質量/周和空腹血糖/周。小鼠于喂養4周后，采剪尾血檢空腹血糖，以放射免疫法測定空腹血清胰島素水平，并計算胰島素敏感指數（Insulin Sensitivity In-dex，ISI）進而評價模型優劣，小鼠體質量、血糖、血清胰島素水平和胰島素抵抗指數的測定，計算公式：ISI=In[1/（空腹血糖×空腹血清胰島素）]。

1.2.3.2?主動脈僵硬度分析?采用SphygmoCor脈搏分析系統分析主動脈脈搏流速（m/s）、主動脈脈搏波增強指數（API）和主動脈脈搏波增強指數（AIX）等指標反映主動脈僵硬度，比較2組患者治療前后上述諸指標變化間差異。用2%異氟醚和氧在2 L/min時對小鼠進行麻醉，仰臥在加熱板上，腿固定在心電圖電極上，通過調整異氟醚濃度，維持目標心率約為450次/min。多普勒探針（20 mhz;鼠標多普勒數據采集系統;在橫斷主動脈弓和腹主動脈放置小動物監護儀（Indus Instruments，美國），用精密卡尺測量探針之間的距離。預射時間，即心電圖的r波和多普勒信號的腳之間的時間，被確定為每個位點。主動脈脈搏波速度（aPWV）的計算方法是將探針之間的距離（cm）除以胸腔和腹腔區域的預射時間（s）差。

1.2.3.3?血管超聲檢測血管內皮功能?Accuson 128×P/10超聲儀在肘關節上2～10 cm描記右肱動脈長軸二維圖像，調節深度及增益得到最清晰的動脈壁與腔的分界面，所有的圖像均錄像在VHS錄像帶上，同時通過CVI acquirsion軟件，每3 s輸入計算機1幅舒張期圖像。第1 min的掃描后，袖帶充氣至300 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），持續5 min后放氣并誘發反應性高血流，再持續記錄3 min的圖像，休息10 min后，再描記1 min基礎圖像后，舌下給予0.4 mg硝酸甘油噴霧劑，再記錄5 min。圖像分析：用CVI分析軟件，測量動脈內膜面至內膜面。內皮依賴性擴張（EDD%）：內皮依賴的血流量介導的擴張反應[FMD（%）]=100×（D最大值-D基礎值）/D基礎值。內皮獨立擴張（EID%）：硝酸甘油介導的擴張反應[GTN-MD（%）]=100×（D最大值-D基礎值）/D基礎值。

1.2.3.4?總RNA分離提取，cDNA合成和實時熒光PCR?使用Trizol（Life Technologies，Grand Island，NY，USA）進行主動脈和PVAT RNA的分離。互補脫氧核糖核酸合成使用iScript（美國Bio-Rad大力神，CA）從0.25 μg/μL RNA 20 μL反應。引物序列見表1。樣本運行在重復使用一個iCycler和智商SYBR綠色Supermix（Bio-Rad）兩步放大（95 ℃ 10 min，其次是退火30 min 60 ℃）總共40循環。基因的表達模式是標準化的持續表達β2微球蛋白基因作為參考。數據歸一化，計算每個樣本的△Cq派生的減去Cq參考基因的基因的興趣。相對定量（△△Cq）被減去派生的△Cq實驗樣本的平均△Cq對照組。計算2△△Cq褶皺變化差異。

1.2.3.5?eNOS蛋白表達水平的測定?秤取小鼠主動脈以提取總蛋白，使用二辛可寧酸蛋白質測定試劑盒（Pierce Biotechnology，USA）通過BCA方法定量蛋白質濃度。然后，將30 μg蛋白質加載到6%～10%聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，然后電轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。在室溫下用5%脫脂乳封閉印跡1 h，并在4 ℃下在以下（1∶200稀釋）一抗中孵育過夜。用Tris-bu加入鹽水沖洗后0.1%吐溫-20，將印跡（1∶500稀釋）與二抗在室溫下孵育1 h。然后使免疫印跡與SuperSignal West Pico Substrate反應，使用成像系統檢測化學發光，并使用Quantity One軟件進行光密度分析，測定與β-肌動蛋白的各條帶灰度比值，以反映目的蛋白表達水平。

1.3?統計學方法?采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析;計量資料采用“均數±標準差”（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析或者重復測量的方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗;計數資料采用百分率（%）表示，組間比較采用χ2分析;以P<0.05為差異有統計學意義。

2?結果

2.1?牛磺酸對小鼠胸主動脈形態學?HE染色后在放大200倍的光學顯微鏡下觀察，結果如圖1所示。CON組小鼠的主動脈內膜光滑，內皮細胞組織完整，無缺損和增厚現象;且中膜層的平滑肌細胞清晰可見，排列整齊，無增生。MD組（MD組）與正常對照組（CON組）比較，其主動脈內膜破壞嚴重，內皮細胞的體積增大，甚至部分脫落和間隙增大，中膜平滑肌細胞排列紊亂。與MD組比較，MD+TUDCA組（MD+牛磺酸）組主動脈壁各層細胞的排列較整齊，病變減輕。

2.2?小鼠體質量、血糖、血清胰島素水平和胰島素抵抗指數的測定?與正常對照組比較，MD+TUDCA組（MD+TUDCA組）小鼠體質量及空腹血清胰島素水平均差異無統計學意義（P>0.05），而空腹血糖升高至（22.4±4.6）mmol/L，ISI降低（P<0.05），差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3?各組反映主動脈僵硬度指標的測定結果?結果比較分析表明，與MD組比較，MD+TUDCA組（MD+TUDCA組）主動脈脈波流速、主動脈脈搏波增強指數及主動脈膨脹度均減輕或降低（P<0.05），差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

2.4?各組血管內皮功能評估結果?為了檢查動脈血管內皮功能的區域差異，我們評估了CON組和MD組小鼠的EDD。MD組小鼠動脈EDD受損，與ER應激抑制劑牛磺酸一起孵育1 h后，從同一小鼠分離出的其他腸系膜動脈EDD增加（35.12±6.13）%差異有統計學意義（P<0.05），MD和MD+牛磺酸組動脈EID差異無統計學意義（P>0.05）。見表4。

2.5?實時熒光定量PCR法測定mRNA相關基因表達?各組小鼠eNOS mRNA表達的水平。與CON組（CON組）比較，MD組中eNOS mRNA表達水平下降（P<0.01）;與MD比較，MD+牛磺酸組eNOS mRNA表達上調，差異有統計學意義（P<0.01）。見表5，圖2。

2.6?Western blot法檢測蛋白水平表達?Western blot法檢測eNOS蛋白水平表達結果顯示，與CON組（CON組）比較，MD組中eNOS蛋白水平表達降低（P<0.05）。由此可知，牛磺酸可著提高eNOS蛋白水平的表達。見表6，圖3。

3?討論

糖尿病是一種嚴重影響人類健康的常見和多發病，具有致殘和病死的危險。會快速發展的動脈粥樣硬化（Athrosclero-sis，As）導致糖尿病[12]。以前的研究證實[13]急性動脈內注射5-甲基四氫葉酸（C-5-methyltetrahydrofolate，5-NTTHF）可提高T1DM患者的局部血管內皮功能。此外，長期口服葉酸對T1DM血管內皮功能的研究表明[14]，其可預防和改善T1DM內功能的損傷。但是牛磺酸對T1DM主動脈僵硬度和內皮功能的影響未見報道。本文用T1DM小鼠模型研究牛磺酸對T1DM內皮功能影響及機制進行了探究。

“中焦受氣取汁，變化而赤是為血”（《靈樞·決氣》），血行脈中，“血載氣，氣行血”，“氣為血之帥”，“血為氣之母”。而“血氣不和，百病乃變化而生”（《素問·調經論》）。絡病學說講絡氣郁滯或虛氣留滯與神經內分泌免疫調節功能異常及血管內皮功能障礙機制相類似。牛黃是脊索動物門哺乳綱牛科動物牛膽囊的膽結石，牛磺酸是牛黃的主要活性成分。牛黃（Calculus Bovis）有益氣強心、溫通化濕的作用。牛磺酸具有內皮保護、抗氧化、抗內源性損傷、降低高膽固醇血癥、抗平滑肌細胞增殖和凋亡等作用。牛磺酸調節多種細胞的功能，包括抗氧化作用、離子運動的調節、神經遞質的調節及與膽汁酸的結合等。研究證實，牛磺酸對胰島素依賴性、非胰島素依賴性以及胰島素耐受性的1型早發型糖尿病的有效性。牛磺酸有利于防治T1DM患兒的并發癥，包括視網膜病變、腎病、神經病變、動脈粥樣硬化和心肌病。

糖尿病患者由于基質發生退化并出現彈力層破碎與斷裂，使得膠原與鈣質發生沉積，主動脈與大動脈的擴張造成動脈僵硬度的增加，而對于病程較長的患者還會由于糖基化的終產物通過血管的內皮功能修復劑炎性反應性反應造成動脈僵硬度的增加。本研究首次證明牛磺酸對動脈硬化具有保護作用。結果顯示，MD組（MD組）與正常對照組（CON組）比較，其主動脈內膜破壞嚴重，內皮細胞的體積增大，中膜平滑肌細胞排列紊亂。MD+牛磺酸組主動脈壁各層細胞的排列較整齊，病變減輕。MD+牛磺酸組小鼠空腹血糖升高，ISI降低;且APV、API和AIX減輕或降低。eNOS mRNA表達上調，表明牛磺酸提高eNOS蛋白水平的表達。MD小鼠腸系膜動脈EDD受損，而頸動脈未發現損傷。沿著動脈差異功能的這一發現證實腸系膜動脈比頸動脈更容易受到代謝紊亂的影響。Kozakova M[15]發現，牛磺酸給藥可以逆轉高脂飲食引起的內皮功能障礙和主動脈內質網應激。eNOS酶是二聚體結構，含有相同的2個亞基，每個亞基分為2個區，C-端為還原酶區，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）及鈣調蛋白（CaM）結合位點;N-端為氧化酶區，含四氫生物蝶呤（BH4）、血紅素和L-精氨酸等結合位點。eNOS可催化黃素介導的電子從結合NADPH的C末端轉移至N末端氧化酶區的血紅素。最近，Fountoulakis N等[16]人報道牛磺酸恢復了轉基因MD小鼠對乙酰膽堿的反應。除了Fountoulakis N等報道的牛磺酸對冠狀動脈內皮功能的有益作用外，Camila M等[17]對牛磺酸改善了外周血管內的內皮功能（即血管內皮功能）。DB小鼠的EID被削弱，這些小鼠的內皮細胞和底層平滑肌細胞都有廣泛的血管功能障礙。然而，牛磺酸對EID反應沒有影響，說明牛磺酸的保護作用是針對EDD的。與之前的研究一致，Ikonomidis I等[18]研究發現慢性牛磺酸治療降低了DB小鼠的動脈硬化。這與其他證明MD小鼠aPWV比CON小鼠升高的研究結果一致。

研究表明[18-20]急性牛磺酸治療和慢性牛磺酸治療均未完全逆轉血管功能障礙。這可能是由于牛磺酸對ER應激的不完全抑制，而ER應激標志物在主動脈和PVAT中的部分減少支持了內質網應激。另外，它可能表明其他因素，獨立于內質網應激，導致DB小鼠的血管損傷。研究表明[21-24]在被檢測的4種UPR遞質中，eNOS mRNA通常是在基因水平而不是蛋白水平上確定的，因為去除26個核苷酸內含子會導致eNO翻譯。在剩余的UPR標記中缺乏蛋白質表達量有限制作用。MD/mb小鼠菌株是T1DM研究中經常使用的菌株;然而，動物模型在代謝紊亂的嚴重程度和對人類疾病的適用性方面并非沒有一定的局限性。

總之，盡管仍有許多問題沒有得到解答，但牛磺酸可以改善MD小鼠的EDD，降低動脈硬化，其可能是治療及預防糖尿病血管功能障礙的新藥物。

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（2019-04-30收稿?責任編輯：王明）