白藜蘆醇聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的抑制作用及機(jī)制

趙桂柱 孫占軍 溫志鵬

摘要?目的：探討白藜蘆醇（Res）聯(lián)合奧沙利鉑（Oxa）對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的抑制作用及機(jī)制。方法：將體外培養(yǎng)結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞分為Res組、Oxa組、聯(lián)合組及對(duì)照組，分別以100 μmoL/L Res、2 μmoL/LOxa、100 μmoL/L Res+2 μmoL/LOxa、等量生理鹽水處理，各組分別處理24、36、48 h。采用噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞增殖抑制情況;采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞侵襲能力;Wound Healing法檢測(cè)結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞遷移能力;采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞波形蛋白（Vimentin）蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：干預(yù)48 h時(shí)，Res組、Oxa組及聯(lián)合組結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞增殖抑制率分別為（28.41±6.25）%、（36.11±8.47）%、（83.61±12.72）%;干預(yù)48 h時(shí)，對(duì)照組、Res組、Oxa組及聯(lián)合組結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞侵襲率分別（97.14±2.81）%、（81.23±4.52）%、（69.84±3.97）%、（37.11±3.58）%;遷移率分別為（68.57±4.02）%、（46.11±3.13）%、（31.25±2.86）%、（18.79±2.21）%;Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.93±0.14、0.52±0.08、0.31±0.04、0.13±0.02。Res組、Oxa組及聯(lián)合組結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞增殖抑制率呈逐漸升高趨勢(shì)（P<0.05）;與對(duì)照組比較，Res組、Oxa組及聯(lián)合組結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞侵襲率、遷移率和Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，且聯(lián)合組顯著低于Res組與Oxa組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：Res與Oxa聯(lián)合使用具有顯著的協(xié)同效應(yīng)，可更有效抑制結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞增殖，并降低其侵襲和遷移能力，其機(jī)制可能與下調(diào)Vimentin蛋白表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞?結(jié)腸癌;白藜蘆醇;奧沙利鉑;增殖;侵襲;遷移;波形蛋白;抗腫瘤;上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

Inhibitory Effect and Mechanism of Resveratrol Combined with Oxaliplatin on the Malignant Biological Behavior of Human Colon Cancer Cells

Zhao Guizhu， Sun Zhanjun， Wen Zhipeng

（Department of Pharmacy， Baogang Hospital， Baotou 014010， China）

Abstract?Objective：To investigate the inhibitory effect and mechanism of resveratrol（Res）combined with oxaliplatin（Oxa）on the malignant biological behavior of human colon cancer cells.Methods：Colon cancer HCT-116 cells were cultured in vitro.The Res group， the Oxa group， the combination group and the control group were treated with 100 μmoL/L Res， 2 μmoL/L Oxa and 100 μmoL/L Res+2 μmoL/L Oxa， the same amount of saline， and each group was treated for 24， 36， 48 h.The inhibition of proliferation of colon cancer HCT-116 cells was detected by MTT assay; Transwell chamber assay was used to detect the invasion ability of colon cancer HCT-116 cells; Wound healing method was used to detect the migration ability of colon cancer HCT-116 cells; The expression of Vimentin protein（vimentin）in colon cancer HCT-116 cells was detected by Western blotting（Wb）method.Results：At 48 h after intervention， the proliferation inhibition rates of HCT-116 cells in the Res group， the Oxa group and the combination group were（28.41±6.25），（36.11±8.47）and（83.61±12.72）%， respectively; At 48 h after intervention， the invasive rates of HCT-116 cells in the control group， the Res group， the Oxa group and the combination group were（97.14±2.81），（81.23±4.52），（69.84±3.97），（37.11±3.58）%， respectively; The mobility rates were（68.57±4.02），（46.11±3.13），（31.25±2.86）， and（18.79±2.21）%， respectively; The relative expression levels of Vimentin protein were（0.93±0.14），（0.52±0.08），（0.31±0.04）， and（0.13±0.02）， respectively.The proliferation inhibition rate of colon cancer HCT-116 cells in the Res group， the Oxa group and the combination group increased gradually（P<0.05）; Compared with the control group， the invasion rate， mobility rate and Vimentin protein expression of HCT-116 cells in the Res group， the Oxa group and the combination group significantly decreased， and the combination group was significantly lower than the Res group and the Oxa group（all P<0.05）.Conclusion：The combination of Res and Oxa has significant synergistic effect， which can inhibit the proliferation of colon cancer HCT-116 cells and reduce its invasion and migration rate， and its mechanism may be related to the down-regulation of Vimentin protein expression.

Key Words?Colon cancer; Resveratrol; Oxaliplatin; Proliferation; Invasion; Migrate; Vimentin; Antitumor; Epithelial-mesenchymal transition

中圖分類號(hào)：R284;R735.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.12.022

奧沙利鉑（Oxa）是繼順鉑和卡鉑之后的第三代鉑類抗癌藥物，具有較好的抗腫瘤效果，且目前已成為臨床治療胃癌及結(jié)直腸癌的一線化療藥物，白藜蘆醇（Res）具有抗腫瘤、抗衰老、抗炎、抗氧化及抗血栓等多種藥理學(xué)作用，已有研究證實(shí)，Res可對(duì)人乳腺癌、肝癌、胃癌、白血病等多種腫瘤細(xì)胞拮抗作用[1]。研究報(bào)道，Oxa和Res聯(lián)用具有協(xié)同抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的作用，其機(jī)制與抑癌基因miR-34c表達(dá)上調(diào)有關(guān)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，Res能逆轉(zhuǎn)人大腸癌細(xì)胞對(duì)Oxa耐藥，進(jìn)而抑制人大腸癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡[3]。本研究旨在探討Res聯(lián)合Oxa對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的抑制作用及機(jī)制，為臨床治療結(jié)腸癌提供指導(dǎo)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?細(xì)胞株?結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞，購自南京凱基生物公司。

1.1.2?藥物?Res（美國Sigma公司，批號(hào)：AM569872），規(guī)格：5 g，純度>99%;Oxa（長沙華美醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司，批號(hào)：201845683），規(guī)格：50 mg。

1.1.3?試劑與儀器?主要試劑：胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司，型號(hào)：CQ-80L）;噻唑藍(lán)（MTT）（美國Sigma公司，型號(hào)：298-93-1）;Matrigel膠（美國BD公司，型號(hào)：40234A）;兔抗人Vimentin多克隆抗體（美國Santa Cruz公司，型號(hào)：AZ050）等。主要儀器：CO2培養(yǎng)箱（英國RS Biotech公司，型號(hào)：GALAXYS）;超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，型號(hào)：SW-CJ-1FD）;小室（美國Corning公司，型號(hào)：Transwell）;光學(xué)倒置顯微鏡（日本OLympus公司，型號(hào)：CKX41）;蛋白垂直電泳儀（上海能科技有限公司，型號(hào)：VE-180）;全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司，型號(hào)：606型）;Image Pro Plus軟件（美國Media Cybernetics公司，型號(hào)：Image Pro Plus）;圖像分析軟件（德國Leica公司，型號(hào)：Leica QWin）。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備

將結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞分為Res組、Oxa組、聯(lián)合組及對(duì)照組。用含10%胎牛血清、100 U/mL青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞[4]，取對(duì)數(shù)期結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞，接種于96孔板中。

1.2.2?給藥方法

Res組、Oxa組、聯(lián)合組及對(duì)照組分別以100 μmoL/L Res、2 μmoL/LOxa、100 μmoL/L Res+2 μmoL/LOxa、等量生理鹽水處理，20 μL/孔，各組分別處理24、36、48 h。

1.2.3?檢測(cè)指標(biāo)與方法

MTT法檢測(cè)結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞增殖抑制情況：細(xì)胞分組及處理同1.2.1，分別于干預(yù)24、36、48 h后，加MTT（5 mg/mL）溶液20 μL，孵育4 h，并設(shè)置8復(fù)孔，且各組均重復(fù)3次[5]。于570 nm波長處檢測(cè)各孔吸光度值OD570 nm。結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD570 nm/對(duì)照組OD570 nm）×100%。

Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞侵襲力：于Transwell小室上室鋪Matrigel基質(zhì)膠50 μL，加無血清DMEM培養(yǎng)基，平衡12 h;胰酶消化，離心，1 500 r/min，5 min，收集對(duì)數(shù)期結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，500 μL/室[6]。于下室置含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，干預(yù)48 h時(shí)，棉簽去除上室上的細(xì)胞，0.5%結(jié)晶紫染色。于光學(xué)倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)量。侵襲率（%）=下室細(xì)胞數(shù)量/細(xì)胞總數(shù)量×100%。

Wound Healing法檢測(cè)結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞遷移能力：將對(duì)數(shù)期細(xì)胞調(diào)整濃度為5×105個(gè)/mL，接種于6孔板中。以200 μL無菌移液器槍頭垂直于單層細(xì)胞劃痕，劃痕面積約10 mm×1 mm。各孔加含0.1%胎牛血清的培養(yǎng)基。由于結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞具有遷移能力，繼續(xù)培養(yǎng)劃痕會(huì)逐步融合，分別于干預(yù)0、24、36、48 h時(shí)在光學(xué)倒置顯微鏡下觀察[7]，以Image Pro Plus軟件計(jì)算劃痕愈合率（%）=（0 h時(shí)劃痕寬度-24/36/48 h時(shí)劃痕寬度）/0 h時(shí)劃痕寬度×100%。

蛋白免疫印跡法檢測(cè)結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞Vimentin蛋白表達(dá)情況：細(xì)胞分組及處理同2.1，收集各組干預(yù)48 h時(shí)的細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，取50 μg進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，以β-actin為內(nèi)參，經(jīng)Leica QWin圖像分析軟件進(jìn)行分析結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)情況[8]。

1.3?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn);多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?各組不同時(shí)間點(diǎn)結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞增殖抑制情況

各組結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞增殖抑制率均隨時(shí)間延長而逐漸升高，且聯(lián)合組顯著高于Res組、Oxa組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2?各組干預(yù)48 h后結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞侵襲能力比較

干預(yù)48 h，對(duì)照組、Res組、Oxa組及聯(lián)合組結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞侵襲率分別為（97.14±2.81）%、（81.23±4.52）%、（69.84±3.97）%、（37.11±3.58）%。與對(duì)照組比較，Res組、Oxa組及聯(lián)合組結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞侵襲率均顯著降低，且聯(lián)合組顯著低于Res組、Oxa組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖1。

2.3?各組干預(yù)后結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞遷移能力比較

干預(yù)24 h時(shí)，對(duì)照組、Res組、Oxa組及聯(lián)合組結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞遷移率分別為（18.41±2.16）%、（6.57±0.54）%、（3.12±0.29）%、（1.24±0.11）%;干預(yù)36 h時(shí)，各組遷移率分別為（37.39±3.22）%、（18.54±2.23）%、（14.11±1.78）%、（2.33±0.25）%;干預(yù)48 h時(shí)，各組遷移率分別為（68.57±4.02）%、（46.11±3.13）%、（31.25±2.86）%、（18.79±2.21）%。隨干預(yù)時(shí)間延長，各組結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞遷移率逐漸升高;與對(duì)照組比較，Res組、Oxa組及聯(lián)合組結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞遷移率均顯著降低，且聯(lián)合組顯著低于Res組與Oxa組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖2。

2.4?各組干預(yù)48 h后結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞Vimentin蛋白表達(dá)情況

干預(yù)48 h，對(duì)照組、Res組、Oxa組及聯(lián)合組結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.93±0.14），（0.52±0.08），（0.31±0.04），（0.13±0.02）。與對(duì)照組比較，Res組、Oxa組及聯(lián)合組Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，且聯(lián)合組顯著低于Res組、Oxa組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖3。

3?討論

Oxa以DNA為作用靶點(diǎn)，通過形成鉑化DNA化合物而抑制DNA的合成，并抑制DNA的修復(fù)，從而激活信號(hào)傳導(dǎo)通路引起細(xì)胞死亡，發(fā)揮抗腫瘤的作用。Res又名茋三酚，是一種天然多酚類的植物抗毒素。研究顯示，Res除具有抗炎、抗氧化、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、調(diào)節(jié)骨代謝及雌激素等多種藥理學(xué)作用外，還可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，抑制癌基因表達(dá)及干預(yù)信號(hào)轉(zhuǎn)錄等發(fā)揮抗腫瘤作用[9]。研究報(bào)道，Oxa可抑制人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與抑制SW620細(xì)胞內(nèi)源性核因子-κB、信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）表達(dá)有關(guān)[10]。高俊英等[11]研究發(fā)現(xiàn)，Res可通過影響上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程、調(diào)控micro RNAs家族的表達(dá)來影響上皮腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移，提示Res可通過抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移控制腫瘤的發(fā)展。也有研究表明，Res可顯著抑制胰腺癌Miapaca-2細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，且其抑制能力與藥物濃度正相關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合組結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞增殖抑制率顯著高于Res組、Oxa組，與對(duì)照組比較，Res組、Oxa組及聯(lián)合組結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞侵襲及遷移率均顯著降低，且聯(lián)合組顯著優(yōu)于Res組與Oxa組，提示Res可抑制結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞增殖，降低其侵襲和遷移能力，且Res與Oxa聯(lián)用具有顯著的協(xié)同效應(yīng)。EMT過程與腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，三氧化二砷和Res聯(lián)合使用可有效抑制肺癌細(xì)胞人侵襲、遷移，可能與下調(diào)Vimentin水平，抑制細(xì)胞基質(zhì)的降解和EMT過程有關(guān)[13]。臧春寶等[14]研究發(fā)現(xiàn)，Res可調(diào)控EMT蛋白表達(dá)，下調(diào)Vimentin蛋白表達(dá)水平，抑制EMT，進(jìn)而降低食管癌細(xì)胞的侵襲、遷移，提示Res可通過抑制EMT發(fā)生，控制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。本研究結(jié)果顯示，Res組、Oxa組及聯(lián)合組Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，且聯(lián)合組顯著低于Res組、Oxa組，提示Res可下調(diào)Vimentin蛋白的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤的作用。

綜上所述，Res能明顯抑制結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞增殖，同時(shí)降低其侵襲、遷移和Vimentin蛋白表達(dá)，與Oxa聯(lián)用，可增強(qiáng)抗腫瘤作用，為臨床治療結(jié)腸癌提供了新思路。

參考文獻(xiàn)

[1]Carter LG，D′Orazio JA，Pearson KJ.Resveratrol and cancer：focus on in vivo evidence[J].Endocr Relat Cancer，2014，21（3）：R209-225.

[2]常環(huán)環(huán)，楊姝，李文帥，等.白藜蘆醇與奧沙利鉑聯(lián)合應(yīng)用抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的機(jī)制[J].解剖學(xué)雜志，2017，40（2）：125-128，136.

[3]王子元，孫筱婷，吳麗莉，等.白藜蘆醇對(duì)人大腸癌耐藥細(xì)胞增殖及凋亡的影響[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，4（3）：55-60.

[4]趙綠翠，廖科，李科瓊，等.吳茱萸堿調(diào)控人結(jié)腸癌HCT 116細(xì)胞中JAK2/STAT3信號(hào)通路的機(jī)制研究[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2015，14（10）：1394-1398.

[5]張喆，陳信義，鄭智.復(fù)方浙貝顆粒藥物血清對(duì)人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞增殖與凋亡的影響[J].中醫(yī)雜志，2015，56（1）：55-58.

[6]楊柳婷，姜蓬壘，祖丹丹，等.NK4基因聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116凋亡和侵襲的影響[J].中國癌癥防治雜志，2017，9（6）：456-461.

[7]諸葛春鳳，劉詩權(quán)，譚林，等.SphK1和FAK對(duì)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響[J].中國病理生理雜志，2016，32（3）：439-444.

[8]Kurokawa K，Akaike Y，Masuda K，et al.Downregulation of serine/arginine-rich splicing factor 3 induces G1 cell cycle arrest and apoptosis in colon cancer cells[J].Oncogene，2014，33（11）：1407-1417.

[9]孫菁，王世卉.白藜蘆醇對(duì)刀豆素A誘導(dǎo)小鼠自身免疫性肝炎的保護(hù)作用[J].貴州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，43（7）：768-774.

[10]林昌榮，楊建榮，李碧錦，等.奧沙利鉑對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞NF-κB、STAT3表達(dá)影響[J].中國公共衛(wèi)生，2015，31（8）：1053-1055.

[11]高俊英，季淑華，鄭兆娣，等.白藜蘆醇抑制上皮腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的機(jī)制[J].生命科學(xué)，2018，30（7）：752-757.

[12]秦勇，馬清涌，黨曉燕，等.白藜蘆醇對(duì)胰腺癌Miapaca-2細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力影響的體外觀察[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2014，35（1）：64-68.

[13]郭天利，李宏健，龐慧，等.三氧化二砷聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲、遷移的影響及機(jī)制[J].中國老年學(xué)雜志，2018，38（12）：2972-2974.

[14]臧春寶，劉云琴，葛寧，等.白藜蘆醇對(duì)食管鱗癌Eca-109細(xì)胞侵襲遷移及EMT的影響[J].蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，40（12）：1617-1620，1623.

（2019-09-27收稿?責(zé)任編輯：楊覺雄）