臺灣早熟蜜桃優良芽變新種質‘五月紅’的鑒定

潘介春 龍薔宇 丁峰 徐石蘭 黃幸 黃思婕 楊亞涵 李峰 張樹偉

摘?要：桃是我國重要的果樹種類，分布十分廣泛，在水果生產中排第四位，但適合南方栽培的品種卻稀少。該研究通過資源調查在廣西大學標本園內的一棵臺灣早熟蜜桃大枝上發現一個芽變新種質，命名為‘五月紅’，并進一步對其主要生物學特性、植物學性狀以及果實經濟性狀等進行觀測分析，同時還通過SRAP分子標記檢測與母株臺灣早熟蜜桃的差異性。結果表明：‘五月紅’芽變新種質成熟期比臺灣早熟蜜桃提前20 d左右，5月上中旬成熟，果變大，核變小，可食率提高，且顏色均勻，可溶性固形物含量顯著提高，保持了臺灣早熟蜜桃需冷量低、品質優良和風味極佳的優點，屬于特早熟優質種質資源;通過瓊脂糖電泳檢測SRAP擴增組合引物me9/em5在‘五月紅’DNA樣品中能夠擴增到1 200 bp大小的特異性條帶，表明‘五月紅’在DNA遺傳水平上與母株臺灣早熟蜜桃發生了變異，屬于新的特早熟種質資源。‘五月紅’芽變新種質的發現將為選育適合南方栽培的特早熟桃品種提供重要材料，有助于優化不同熟期品種的栽培結構，進而促進南方桃種植產業經濟效益的提高。

關鍵詞： 桃， 芽變， 早熟， 種質資源， 育種

Identification of a new bud sport germplasm ‘May Red’ from Taiwan precocious peach

PAN Jiechun1， LONG Qiangyu1， DING Feng2*， XU Shilan1， HUANG Xing1， HUANG Sijie1， YANG Yahan1， LI Feng1， ZHANG Shuwei2

（ 1. College of Agriculture Guangxi University， Nanning 530004， China; 2. Horticultural Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning 530007， China ）

Abstract：Peach is an important fruit tree species in China， which is widely distributed and ranks the fourth in fruit production. However， there are few varieties suitable for southern cultivation. Through resource surveys in specimen garden of Guangxi University， a new bud sport germplasm was found on a branch of Taiwan precocious peach tree， named ‘May Red’. Its main biological characteristics， botanical traits， fruit economic traits and so on were observed and analyzed. At the same time， SRAP molecular markers were used to detect the differences between ‘May Red’ and Taiwan precocious peach. The results showed that the maturity of ‘May Red’ was about 20 d earlier than that of Taiwan precocious peach， matured in mid-May with large fruit， smaller nucleus and higher edible rate. Moreover， the color was uniform， the soluble solids content was significantly increased， and it maintained the advantages of low cold requirement， excellent qua-lity and excellent flavor of Taiwan precocious peach. It belonged to especially early maturing and high quality germplasm resources. The specific bands of 1 200 bp in ‘May Red’ DNA samples were amplified by SRAP primers me9/em5 by agarose electrophoresis， which indicates that ‘May Red’ are mutated at the DNA genetic level and belongs to a new especially early maturinggermplasm resource. The discovery of ‘May red’ will provide important materials for the breeding of especially early maturing peach varieties. It will help to optimize the cultivation structure of different mature varieties and promote the economic benefit of southern peach planting industry.

Key words： peach， bud sport， early maturity， germplasm resources， breeding

桃（Amygdalus persica）屬于薔薇科（Rasaceae）、桃屬（Prunus），起源于我國的最古老果樹之一，栽培歷史悠久，分布十分廣泛，是我國重要的果樹種類，在水果生產中排第四位。目前全世界共有品種5 000余個，我國約有1 000個品種（陳臨等，2007）。我國桃主要經濟栽培地區在中田華北、華東各省，較為集中的地區有北京、山東、河南、河北、陜西、甘肅、四川、遼寧等。南方也有少量地區種植，例如臺灣、廣西、廣東、浙江、江蘇等地區。但隨著我國桃產業的快速發展，南方產區在桃品種栽培結構優化上起著關鍵的作用，特別是在早、中熟品種生產上，逐漸成為實施桃發展的重點區域，然而也面臨著諸多問題：一方面，南方桃產區在我國桃市場中不占優勢，而且南方桃一般果個較小，品質較差，肉質軟，只能就近銷售;另一方面，特早熟品種所占比例甚小，桃采后保鮮困難，桃成熟上市期大量集中在6—7月，常造成價格低廉，嚴重制約著南方桃產業經濟效益的提高。造成以上問題的一個主要原因在于目前缺乏適合南方生產的特早熟優質桃品種。

我國南方桃產區由于需冷量的限制，更適合發展早、中熟品種。因此，我們應該利用自身自然環境優勢，培育更早熟的品種，來延長鮮果供應期，搶占早熟市場，可以有效調節南方桃的產期，提高桃的生產效益。前期課題組通過資源調查，在一棵臺灣早熟蜜桃上發現一個芽變突變體，命名為‘五月紅’。臺灣早熟蜜桃本身就具有適應性廣、速生、豐產、早熟等優點，果實外觀艷麗，品質極優，果實硬熟時肉質細脆清甜爽，無酸味，果實完全成熟后肉質變軟汁液增多，味香氣濃郁，是一種高產、優質、高效又適宜在南方地區推廣栽培的優良鮮食水蜜桃品種（黃德發和韓少燕，2002）。‘五月紅’保留臺灣早熟蜜桃優良性狀的同時，成熟期提早20 d左右，5月上中旬成熟，屬特早熟優質種質資源。‘五月紅’的發現將為特早熟桃品種的選育提供重要材料，對今后桃品種栽培結構的優化、提早桃的上市時間、有效延長鮮桃產品的供應期有很好的幫助，進而促進桃經濟效益的提高。

1?材料與方法

1.1 材料

供試材料為臺灣早熟蜜桃和其芽變新種質‘五月紅’，樣品采自廣西大學農學院果樹標本園（3年生嫁接苗），選取健康植株上的老熟葉片，采摘洗凈放入液氮再放入-20 ℃冰箱中保存（分別采集‘五月紅’和臺灣早熟蜜桃不同株系的兩個平行重復樣品）。EX Taq DNA聚合酶、dNTP購自TIANGEN公司，DL2000 DNA Marker、植物DNA提取試劑盒等購自上海生工生物工程技術服務有限公司，同時相關引物也由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 樣品采集和處理

試驗樹的果實在果實成熟期進行采集，采用完全隨機采樣，臺灣早熟蜜桃和其芽變新種質‘五月紅’各隨機選擇5棵漲勢相當的植株進行采集，時間為2018年5月14日。在每棵果樹中上部東、南、西、北四個方位選擇大小均勻、色澤一致、無病蟲、無損傷的健康果實進行采集，每個方位采集4個果實，共16個，用密封袋封好帶回實驗室處理。

1.3 方法

1.3.1 選育過程?2014年在廣西南寧市西鄉塘區大學東路100號廣西大學標本園內的一棵臺灣早熟蜜桃果樹側枝上發現一早熟優良芽變新種質資源，暫定名‘五月紅’。2015年從‘五月紅’突變枝條采集接穗進行嫁接進一步觀察（砧木為2年生臺灣早熟蜜桃），開展了該優良芽變種質資源的選育研究。‘五月紅’嫁接苗于第二年開始正常開花結果，2016—2018年連續三年對其生物學特征、植物學性狀 、果實的經濟性狀、遺傳穩定性等進行觀察和評價，具體指標按照《桃種質資源描述規范和數據標準》描述和評價（王力榮等，2005），同時開展分子生物學SRAP分子標記檢測。

1.3.2 果實品質的測定?從采集的果實樣品中隨機取出10個果實測定經濟性狀，包括果實橫縱徑、果核橫縱徑、果實可溶性固形物、果實單果重等，然后取平均值并做顯著差異性分析。具體測定方法如下：果實橫縱徑測定采用游標卡尺直接測量;果實可溶性固形物測定采用PAL-1數顯糖度計（日本）測定;果實單果重測定用電子天平稱重，取均值;果實可食率根據測定的單果重均值和果肉單果重均值計算所得。

1.3.3 ‘五月紅’和臺灣早熟蜜桃基因組 DNA 的提取?從冰箱中分別取出提前采集好的‘五月紅’和臺灣早熟蜜桃老熟葉片材料，參考桃葉片總DNA的提取方法（張南南等，2018），提取樣品的總DNA，最終將DNA稀釋到50 ng·μg-1，放入-20 ℃冰箱備用（分別提取‘五月紅’和臺灣早熟蜜桃不同株系的兩個生物學重復DNA樣品）。

1.3.4 SRAP分析?根據郭瑞等（2009）和史紅麗等（2009）已發表的24 對SRAP引物組合進行擴增，分別為me1/em1 、me2/em2 、me3/em3 、me4/em4、me5/em5 、me1/em5、me3/em6、me3/em11、me4/em10、me4/em11、me6/em5、me6/em6、me7/em4、me7/em6、me7/em10、me7/em11、me9/em5、me9/em6 、me9/em8、me9/em11、me10/em2、me10/em5、me10/em7、me10/em9，引物序列見表2。PCR 擴增反應在 MasterCycler Gradi-ent 梯度 PCR 儀（Eppendorf）上完成 。采用EX Taq DNA聚合酶（TaKaRa）進行PCR擴增，反應體系為20 μL，各組分含量按照酶試劑說明書進行（注：DNA模板分別為‘五月紅’和臺灣早熟蜜桃不同株系的兩個生物學重復DNA樣品）。擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min，35 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，5個循環;94 ℃變性1 min，50 ℃復性1 min ， 72 ℃延伸1 min，35個循環;循環結束后72 ℃延伸10 min，擴增產物用1.5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測。

2?結果與分析

2.1 生物學特性

臺灣早熟蜜桃和‘五月紅’在廣西南寧市的花期相同，均在2月10日左右開花，兩者坐果時間在3月16日左右，然而果實轉色期有明顯差別，‘五月紅’ 在4月中旬左右進入轉色期，而臺灣早熟蜜桃轉色期在4月下旬左右。‘五月紅’成熟期在5月7日左右，而臺灣早熟蜜桃的成熟期則在5月28日左右，兩者相差20 d左右。‘五月紅’開花時間和臺灣早熟蜜桃一樣，但果實成熟時間提早，表明造成‘五月紅’果實早熟的主要原因是其果實發育的速度比臺灣早熟蜜桃快。

2.2 植物學性狀

‘五月紅’芽變植株生長勢強，樹姿開張。樹干表面也為灰褐色，樹干表面粗糙，有裂縫。一年生枝條顏色向陽面為紅褐色，陰面為綠色，具有大量小皮孔。葉長橢圓披針形，長 × 寬約為14 cm × 4 cm，葉基楔形，葉片側脈末端交叉，葉腺腎形，數量2～3個，葉尖漸尖，葉緣鈍鋸齒狀，葉面無毛綠色，葉被淺綠色。花單生，先于葉開花，呈薔薇型單瓣，花瓣長圓狀橢圓形至寬倒卵形，粉紅色。花梗極短，萼筒鐘形，被短絨毛。萼片卵形，頂端圓鈍，外被短絨毛。雄蕊深粉色，花藥橙黃色，花粉多。花柱比雄蕊長，子房被短柔毛。

2.3 主要果實經濟性狀

‘五月紅’果實和臺灣早熟蜜桃果實的主要經濟性狀和生物學性狀分別如表1和表2所示。在果型、縫合線深淺、果實對稱性、茸毛密度、梗洼深度、梗洼寬度、果皮底色、蓋色深淺、著色程度以及著色類型上兩者沒有差異。同時在果皮剝離度、果肉顏色、紅色素含量、裂果率、核粘離性、鮮核顏色、汁液多少、裂核率、風味、纖維含量等性狀上也表現出一致性。然而，‘五月紅’果實和臺灣早熟蜜桃相比最明顯的差異在于：一是‘五月紅’的成熟期比臺灣早熟蜜桃的成熟期早。在廣西南寧，臺灣早熟蜜桃的成熟期一般在5月下旬，而‘五月紅’果實的成熟期則在5月上旬，兩者成熟期相差20 d左右。二是‘五月紅’的果實比臺灣早熟蜜桃大（圖1），前者單果重、縱徑、橫徑、側徑平均值分別為55.78 g、52.00 mm、46.98 mm、47.90 mm，后者單果重、縱徑、橫徑、側徑平均值分別為43.43 g、50.08 mm、43.96 mm、44.64 mm。‘五月紅’不僅平均單果重比臺灣早熟蜜桃的重，而且核也比臺灣早熟蜜桃的小（圖2），前者鮮核重、核長、核寬、核厚平均值分別為2.96 g、27.24 mm、15.69 mm、13.58 mm，后者鮮核重、核長、核寬、核厚平均值分別為3.33 g、30.08 mm、17.98 mm、13.80 mm。因此，‘五月紅’果實可食率比臺灣早熟蜜桃果實可食率高（達到

94.69%），臺灣早熟蜜桃可食率只有92.33%。三是‘五月紅’的果實品質比臺灣早熟蜜桃的好，‘五月紅’的可溶性固形物含量比臺灣早熟蜜桃的高（達到16.83%），臺灣早熟蜜桃的可溶性固形物含量只有12.4%。以上結果表明，‘五月紅’保持了臺灣早熟蜜桃品質優良和風味極佳的優點外，果實變大，種核變小，可食率提高，且可溶性固形物含量增高香氣變濃，屬于特早熟優質種質資源。

2.4 SRAP分子標記鑒定

參考從桃子中篩選出的24對SRAP引物進行PCR擴增，發現引物me9/em5能夠區分臺灣早熟蜜桃和其芽變種質資源‘五月紅’。從圖3中可以看出，兩個生物學重復‘五月紅’樣品在1 200 bp處都有一特異條帶，而兩個生物學重復臺灣早熟蜜桃樣品沒有。以上結果表明，‘五月紅’在DNA水平上發生了突變，是一個新的特早熟優良種質資源。

3?討論與結論

我國是桃的主要生產國，已成為農民脫貧致富奔小康的重要經濟來源，然而在生產中早、中、晚熟品種結構不合理，中熟品種較多，特早熟和特晚熟品種較少，大多集中在6—7月成熟，又因為桃采后不易貯藏，導致上市期過于集中，常造成價格偏低，果農損失嚴重，豐產年而不豐收。因此，選育特早和特晚熟優質桃品種，拉長鮮果供應期成為解決產期過于集中的一個重要途徑。

芽變是園藝類植物品種選育的一個重要途徑，通常指芽的分生組織細胞自然發生的遺傳物質的突變，進而導致植物遺傳性狀的改變，包括抗逆性、植物學性狀、經濟學性狀等各個方面，其中經濟學性狀包括果實形狀、大小、香氣、顏色、營養成分、甜度、可食率、種子大小等。本研究前期通過田間考察發現了臺灣早熟蜜桃芽變突變體‘五月紅’，后期對其生物學特性、植物學性狀以及主要果實經濟性狀的觀察，發現其保留了臺灣早熟蜜桃豐產、速生、果實艷麗、果肉香甜等優點外，也存在顯著有益的突變，成熟期進一步提前、果實變大、種核變小、可溶性固形物含量增高、果實香氣變濃等主要經濟性狀的變化。為了進一步證明‘五月紅’在DNA遺傳物質上發生了突變，我們通過SRAP分子標記對‘五月紅’和臺灣早熟蜜桃進行遺傳多樣性鑒定，發現兩者存在差異。這表明‘五月紅’是一個新的特早熟優良種質資源。

本研究在物候期觀察發現‘五月紅’和臺灣早熟蜜桃花期和坐果期相同， 最終因轉色期的不同造成兩者成熟期存在顯著差異。大多數桃品種果實成熟時的一個主要標志是果皮著色而呈現鮮艷的紅色，桃果皮轉色是一個花色素苷合成積累的過程，最終果皮呈現出鮮艷的紅色，而這一過程受PpIDS基因控制（梁敏平等，2018）。現研究表明花色素苷的生物合成是通過類黃酮代謝途徑完成的，參與的結構基因主要有花色素合成酶（anthocyanidin synthase，ANS）、類黃酮糖基轉移酶（UDP-glucose：flavonoid 3-O-glucosyltransferase，UFGT）、黃烷酮3-羥化酶（flavanone 3-hydroxylase，F3H）、查爾酮異構酶（chalcone isomerase，CHI）、查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）等（Winkel-shirley， 2001;Springob et al.， 2003）。最近研究表明，主要有MYB、bHLH（basic helix-loop-helix）以及WD40蛋白三大類轉錄因子相互作用形成復合體MBW（MYB-bHLH-WD40）通過調控以上結構基因的表達進而調控花色素苷的生物合成（Zimmermann et al.， 2004;Xu et al.， 2015）。本研究中，‘五月紅’轉色期提前可能是花色素苷合成基因或其他調控轉錄因子如MYB等發生突變造成。‘五月紅’果實變大而可溶性固形物增高是另一顯著突變性狀。果實變大可能是由于在果實發育膨大期細胞分裂速度和細胞體積增大速度比臺灣早熟蜜桃快造成的。可溶性固形物主要是指可溶性的糖類，包括單糖、雙糖以及多糖等，‘五月紅’果實變大而可溶性固形物增高可能是由于一些糖代謝路徑相關基因發生突變導致可溶性糖類合成加速或代謝、轉運受阻造成。今后將基于高通量測序的生物信息學分析手段以及分子生物學技術從分子水平上研究‘五月紅’主要果實經濟性狀發生突變的機理。

本研究中，‘五月紅’成花需冷量少且早熟，其平均單果重明顯大于臺灣早熟蜜桃，成熟期比臺灣早熟蜜桃提早20 d左右，果實品質也明顯優于臺灣早熟蜜桃。受需冷量的限制，我國桃的主要產區不在南方，然而可以利用南方地理環境和氣候的優勢，發展需冷量低的特早熟品種，是桃栽培結構優化的一個重要途徑。目前，適合南方栽培需低冷量的優良品種稀少，‘五月紅’的發現為我國南方特早熟桃的發展提供了重要的育種材料。

參考文獻：

CHEN L， CHEN MJ， SONG LJ， et al.， 2007. Advances in genetic linkage map of peach and its application in molecular assisted breeding [C]. Establishment of Peach Branch of Chinese Horticulture Society and Academic Seminar.[陳臨， 陳妙金， 宋麗娟， 等， 2007. 桃遺傳連鎖圖譜研究進展及其在分子輔助育種中應用展望 [C]. 中國園藝學會桃分會成立大會暨學術討論會論文集.]

GUO R， LI XY， WANG LR， et al.， 2009.Peach SRAP system optimization and SSR peach varieties in the comparative identification [J]. Acta Agric Boreal-Sin， 24（4）： 102-105.[郭瑞， 李曉燕， 王力榮， 等，

2009. 桃SRAP體系的優化及與SSR在桃品種鑒定上的比較 [J]. 華北農學報， 24（4）：102-105.]

HUANG DF， HAN SY， 2002. Cultivation techniques of early ripening and high quality Taiwan Precocious Peach [J]. Fujian Fruits， 119： 51-52.[黃德發， 韓少燕， 2002. 臺灣早熟優質水蜜桃栽培技術 [J]. 福建果樹， 119：51-52.]

LIANG MH， YANG ZF， SU XG， et al.， 2018. Cloning and expression analysis of ζ-carotene desaturase gene in peach fruit [J]. J S Agric， 49（5）：825-831. [梁敏華， 楊震峰， 蘇新國， 等， 2018. 桃果實ζ-胡蘿卜素脫氫酶基因克隆及表達分析 [J]. 南方農業學報， 49（5）：825-831.]

SHI HL， HAN MY， ZHAO CP， 2009. Genetic diversity analysis of Prunus persica using SRAP and SSR markers [J]. Acta Agric Boreal-Sin， 24（6）： 187-192.[史紅麗， 韓明玉， 趙彩平， 2009. 桃遺傳多樣性的SRAP 和SSR 標記分析 [J]. 華北農學報， 24（6）：187-192.]

SPRINGOB K， NAKAJIMA J， YAMAZAKI M， et al.， 2003. Recent advances in the biosynthesis and accumulation of anthocyanins [J]. Nat Prod Rep， 20（3）： 288-303.

WANG LR， ZHU GR， FANG WC， et al.， 2005. Specification and data standard for description of peach germplasm resources [M]. Beijing： China Agricultural Publishing House.[王力榮， 朱更瑞， 方偉超， 等， 2005. 桃種質資源描述規范和數據標準 [M]. 北京：中國農業出版社.]

WINKEL-SHIRLEY B， 2001. Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics， biochemistry， cell biology， and biotechnology [J]. Plant Physiol， 126（2）： 485-493.

XU W， DUBOS C， LEPINIEC L， 2015. Transcriptional control of flavonoid biosynthesis by MYB-bHLH-WDR complexes [J]. Trends Plant Sci， 20（3）：176-185.

ZHANG NN， NIU L， CUI GC， et al.， 2018. Establishment and application of a high-throughout protocol for peach （Prunus persica） DNA extraction [J]. Sci Agric Sin， 51（13）： 2614-2621.[張南南， 牛良， 崔國朝， 等， 2018. 一種高通量提取桃DNA方法的建立與應用 [J]. 中國農業科學， 51（13）：2614-2621.]

ZIMMERMANN IM， HEIM MA， WEISSHAAR B， et al.， 2004. Comprehensive identification of Arabidopsis thaliana MYB transcription factors interacting with R/B-like BHLH proteins [J]. Plant J， 40（1）：22-34.